Войти
На этой схеме показана концепция электронной томографии. Образец отображается в ПЭМ, поскольку он наклонен под разными углами, что приводит к «серии наклона» 2D-изображений (вверху). Затем эта серия наклона с помощью вычислений преобразуется в трехмерную «томограмму» (внизу). Электронная криотомография (CryoET ) - это метод визуализации, используемый для получения изображений высокого разрешения (~ 1–4 нм) трехмерные изображения образцов, обычно биологических макромолекул и клеток. CryoET - это специализированное приложение трансмиссионной электронной криомикроскопии (CryoTEM), в котором образцы отображаются при наклоне, что приводит к серии 2D-изображений, которые можно комбинировать для создания 3D-реконструкции, аналогичной Компьютерная томография человеческого тела. В отличие от других методов электронной томографии, образцы иммобилизуют в некристаллическом («стекловидном») льду и визуализируют в криогенных условиях (< −150 °C), allowing them to be imaged without dehydration or chemical fixation, which could otherwise disrupt or distort biological structures.
Пример электронной криотомографии. На изображении показан центральный срез через томографическую реконструкцию неповрежденного клетка Bdellovibrio bacteriovorus. Масштаб 200 нм. В электронной микроскопии (EM) образцы визуализируются в сверхвысоком вакууме. Такой вакуум несовместим с биологическими образцами, такими как клетки; вода выкипит, и разница в давлении приведет к взрыву ячейки. Поэтому в методах ЭМ при комнатной температуре образцы готовят путем фиксации и обезвоживания. Однако другой подход к стабилизации биологических образцов - их замораживание (электронная криомикроскопия ). Как и в других методах электронной криомикроскопии, образцы для CryoET (типичный маленькие клетки (например, Бактерии, археи или вирусы ) получают в стандартных водных средах и наносят на сетку ЭМ. Затем сетка погружается в криоген (обычно этан ) настолько эффективный, что молекулы воды не успевают перестроиться в кристаллический решетка. Получающееся в результате состояние воды называется «стекловидным льдом» и сохраняет естественные клеточные структуры, такие как липидные мембраны, которые обычно разрушаются при замораживании. Затем образцы, замороженные погружением, хранятся и визуализируются при температурах жидкого азота, так что вода никогда не нагревается настолько, чтобы кристаллизоваться.
Образцы отображают в просвечивающем электронном микроскопе (ТЕМ). Как и в других методах электронной томографии, образец наклоняется под разными углами относительно электронного луча (обычно каждые 1 или 2 градуса от примерно -60 ° до + 60 °), и изображение получается в каждом угол. Затем эту серию изображений с наклоном можно реконструировать с помощью вычислений в трехмерное изображение интересующего объекта. Это называется томограммой или томографической реконструкцией.
В просвечивающей электронной микроскопии (TEM), поскольку электроны сильно взаимодействуют с веществом, разрешение ограничено толщиной образца. Кроме того, толщина образца увеличивается по мере того, как образец наклоняется, и более толстые образцы могут полностью блокировать электронный луч, делая изображение темным или полностью черным. Следовательно, для CryoET образцы должны иметь толщину менее ~ 500 нм для достижения «макромолекулярного» разрешения (~ 4 нм). По этой причине большинство исследований ЭСТ было сосредоточено на очищенных макромолекулярных комплексах, вирусах или небольших клетках, таких как клетки многих видов бактерий и архей.
Более крупные клетки и даже ткани можно подготовить для CryoET путем разбавления либо путем криосрезов, либо путем измельчения сфокусированным ионным пучком (FIB). При криосрезе замороженные блоки клеток или ткани делятся на тонкие образцы с помощью крио- микротома. При фрезеровании FIB замороженные образцы подвергаются воздействию сфокусированного пучка ионов, обычно галлия, который точно удаляет материал с верхней и нижней части образца, оставляя тонкую пластинку, подходящую для визуализации ECT.
Сильное взаимодействие электронов с веществом также приводит к эффекту анизотропного разрешения. Поскольку образец наклоняется во время визуализации, электронный луч взаимодействует с относительно большей площадью поперечного сечения при более высоких углах наклона. На практике углы наклона более 60–70 ° не дают много информации и поэтому не используются. Это приводит к «отсутствующему клину» информации на окончательной томограмме, что снижает разрешение параллельно электронному пучку.
Для структур, которые присутствуют в нескольких копиях на одной или нескольких томограммах, более высокое разрешение (даже ≤1 нм) можно получить усреднением субтомограмм. Подобно анализу одиночных частиц, усреднение субтомограмм объединяет в расчетах изображения идентичных объектов для увеличения отношения сигнал / шум.
. Основным препятствием в CryoET является идентификация представляющих интерес структур в сложных клеточных средах. Одним из решений является применение коррелированной крио- флуоресцентной световой микроскопии и даже световой микроскопии сверхвысокого разрешения (например, cryo-PALM) и CryoET. В этих методиках образец, содержащий интересующий флуоресцентно-меченый белок, замораживают и сначала визуализируют в световом микроскопе, оборудованном специальным предметным столиком, позволяющим хранить образец при температурах субкристаллизации (< −150 °C). The location of the флуоресцентный сигнал идентифицируется, и образец переносится в CryoTEM, где то же место затем отображается с высоким разрешением с помощью CryoET.
