Криофиксация

Криофиксирование - это метод фиксации или стабилизации биологических материалов в качестве первого шага в подготовке образцов для электронная микроскопия и криоэлектронная микроскопия. Типичные образцы для криофиксации включают небольшие образцы растений или животных ткани, клеточные суспензии микроорганизмов или культивируемых клеток, суспензии вирусов или капсидов вирусов и образцов очищенных макромолекул, особенно белков.

Метод включает сверхбыстрое охлаждение небольших образцы тканей или клеток до температуры жидкого азота (-196 ° C) или ниже, останавливая все движения и метаболическую активность и сохраняя внутреннюю структуру путем замораживания всех жидких фаз твердых веществ. Обычно образец погружают в жидкий азот или в жидкий этан или жидкий пропан в контейнере, охлаждаемом жидким азотом. Конечная цель - заморозить образец настолько быстро (со скоростью 10–10 К в секунду), чтобы кристаллы льда не могли образоваться или не могли вырасти настолько, чтобы вызвать повреждение ультраструктуры образца.. Формирование образцов, содержащих образцы в аморфном льду, является «святым Граалем » биологической криомикроскопии.

На практике очень трудно достичь достаточно высоких скоростей охлаждения. для получения аморфного льда в образцах толщиной более нескольких микрометров. С этой целью погружение образца в жидкий азот при его температуре кипения (−196 ° C) не всегда приводит к достаточно быстрому замораживанию образца по нескольким причинам. Во-первых, жидкий азот быстро закипает вокруг образца, образуя пленку изолирующего газа N. 2, которая замедляет передачу тепла криогенной жидкости, известную как эффект Лейденфроста. Скорость охлаждения можно улучшить, прокачивая жидкий азот с помощью пластинчато-роторного вакуумного насоса в течение нескольких десятков секунд перед тем, как погрузить в него образец. Это понижает температуру жидкого азота ниже точки его кипения, так что когда образец погружается в него, он плотно обволакивает образец на короткий период времени и более эффективно отводит от него тепло. Еще более быстрое охлаждение может быть получено путем погружения образцов в жидкий пропан или этан (этан оказался более эффективным), охлажденный очень близко к их точкам плавления, используя жидким азотом или ударяя образец о полированные металлические поверхности, охлаждаемые жидким азотом, сделанные из меди или серебра. Во-вторых, два свойства самой воды препятствуют быстрому криофиксации крупных образцов. теплопроводность льда очень низкая по сравнению с металлами, и вода выделяет скрытую теплоту плавления при замерзании, предотвращая быстрое охлаждение образцов. толщиной более нескольких микрометров.

Высокое давление помогает предотвратить образование крупных кристаллов льда. Самостоятельное быстрое замораживание под давлением (SPRF) может использовать множество различных криогенов, что в последнее время рекламируется как привлекательная и недорогая альтернатива замораживанию под высоким давлением (HPF).