Войти
Матричная лазерная десорбционная ионизация электрораспылением (MALDESI) была впервые представлена в 2006 году как новый метод ионизации окружающей среды, который сочетает в себе преимущества электрораспылительной ионизации (ESI) и лазерной десорбции / ионизации с использованием матрицы (MALDI). В MALDESI можно использовать инфракрасный (ИК) или ультрафиолетовый (УФ) лазер для резонансного возбуждения эндогенного или экзогенного матрикса. Термин « матрица » относится к любой молекуле, которая присутствует в большом избытке и поглощает энергию лазера, тем самым облегчая десорбцию молекул аналита. Первоначальный дизайн MALDESI был реализован с использованием обычных органических матриц, подобных тем, которые используются в MALDI, вместе с УФ-лазером. Текущий источник MALDESI использует эндогенную воду или тонкий слой экзогенно отложенного льда в качестве энергопоглощающей матрицы, где симметричные и асимметричные растягивающие связи ОН резонансно возбуждаются лазером среднего ИК диапазона.
Схема источника изображения IR-MALDESI Источник IR-MALDESI можно использовать для масс-спектрометрической визуализации (MSI), метода, использующего данные МС, анализируемые из области образца, для обнаружения сотен и тысяч биомолекул и визуализации их пространственного распределения. Источник ИК-MALDESI MSI была разработана и внедрена в 2013 году, и соединен с высокой разрешающей способностью гибридного квадрупольного - Orbitrap масс - спектрометра. Моторизованный столик с компьютерным управлением и камера устройства с зарядовой связью (CCD) помещены в корпус, продуваемый азотом, где можно регулировать окружающие ионы и относительную влажность. Термоэлектрическая пластина Пельтье с водяным охлаждением используется для контроля температуры предметного столика (от -10 ° C до 80 ° C). Источник может выполнять однократную или многократную съемку с регулируемой плотностью потока излучения лазера, частотой повторения и задержкой между запуском лазера и накоплением ионов МС.
За последние десять лет революционные разработки в области лазерной технологии, сбора данных, программного обеспечения для управления двигателем (RastirX) и программного обеспечения для обработки изображений (MSiReader) продвинули IR-MALDESI как мощный инструмент для прямого анализа и MSI различных биологических, судебно-медицинские и фармацевтические образцы.
В типичном эксперименте MALDESI MS на образец наносится тонкий слой льда в качестве энергопоглощающей среды. Для десорбции нейтральных материалов из биологических образцов используется лазер среднего ИК-диапазона, который возбуждает в воде режим растяжения ОН. Шлейф десорбированных соединений взаимодействует с ортогональным шлейфом электрораспыления, где они разделяются на заряженные капли электрораспыления и ионизируются посредством процесса, аналогичного ESI. Затем ионы вводятся в масс-спектрометр. Механизм ионизации, подобный ESI, был экспериментально продемонстрирован и подробно изучен, демонстрируя такую же мягкость, как ESI, и позволяя обнаруживать интактные белковые комплексы.
Формирование ледяной матрицы начинается с продувки камеры до относительной влажности ниже 12% с помощью источника сухого газообразного азота перед охлаждением ступени Пельтье до -10 ° C. После этого охлажденный образец подвергается воздействию относительной влажности окружающей среды, что вызывает быстрое образование слоя льда на образце. Толщина льда поддерживается на протяжении всего эксперимента за счет поддержания относительной влажности в помещении на уровне 10% ± 2% за счет продувки корпуса азотом. Ранее лед использовался в качестве матрицы в экспериментах IR-MALDI; однако выходы ионов для таких экспериментов были очень низкими. Электрораспыление после ионизации, используемое в IR-MALDESI, помогает решить проблемы, связанные с низким выходом ионизации. Было показано, что экзогенно отложившаяся ледяная матрица увеличивает содержание ионов примерно в 15 раз.
MALDESI - это сложная интерактивная система, в которой сложно создать оптимальную геометрию всего за один эксперимент. Экспериментальные настройки, связанные с обменом данными между столиком отбора проб, масс-спектрометром и лазерной десорбцией, такие как высота столика, расстояние до точки ESI и частота повторения лазерных лучей, подверглись прогрессивной оптимизации с помощью нескольких планов экспериментов (DOE). В дополнение к оптимизации геометрии источника, состав растворителя для электрораспыления влияет на сигналы MALDESI (т.е. влияет на охват молекул и содержание ионов). В исследовании, направленном на улучшение обнаружения тканеспецифических липидов, параметры электроспрея были адаптированы для положительной и отрицательной полярности ионизации. При оптимальных параметрах содержание липидов увеличивалось в 3 раза при увеличении покрытия на 15% при положительной полярности, в то время как в режиме отрицательной полярности содержание липидов увеличивалось в 1,5 раза при увеличении покрытия на 10%.
В то время как первое поколение системы MALDESI было связано с масс-спектрометром с ионным циклотронным резонансом с преобразованием Фурье (FT), источник тока сопряжен с масс-спектрометром Thermo Exploris 240 или Q Exactive Plus, оснащенным масс-анализатором Orbitrap. Эти масс-анализаторы предлагают одинаково точные измерения массы, но, как правило, сокращают продолжительность сбора данных. Источник MALDESI также может быть подключен к спектрометру ионной подвижности с дрейфовой трубкой - масс- спектрометру (IMS-MS) для высокопроизводительного скрининга. Эти интеграции обеспечивают более надежные исходные данные для MSI, а также прямой анализ различных биологических образцов, поскольку длительное время анализа может вызвать физиологические изменения в исследуемых образцах.
MSiReader - это приложение Matlab, обеспечивающее визуализацию и анализ точных массовых данных с высоким разрешением, собранных с помощью MALDESI. MSiReader был разработан в Университете штата Северная Каролина и впервые был выпущен в 2013 году. Теперь он стал одним из наиболее важных бесплатных программ с открытым исходным кодом для данных MSI и совместим с наиболее распространенными форматами данных MSI (например, mzXML, imzML, img, ASCII ). В MSiReader доступно множество важных функций, а именно создание тепловой карты с высокой точностью измерения массы, нормализация пиков, абсолютное и относительное количественное определение и переключение полярности. В MSiReader также добавлены расширенные функции, такие как анализ основных компонентов (MSiPCA), MSiCorrelation и 3D-визуализация. На сегодняшний день MSiReader используется более 1250 исследователями и цитируется в более чем 325 публикациях с 2013 года. Он выпущен под лицензией BSD 3 с открытым исходным кодом и может быть бесплатно загружен с общедоступного веб-сайта MSiReader www.msireader.com. Также доступна автономная версия, не требующая лицензии Matlab.
Программное обеспечение Rastir, также построенное на платформе Matlab, было разработано, чтобы позволить пользователям визуально определять прямоугольную область интереса (ROI), окружающую срез ткани для экспериментов MALDESI. Rastir автоматически генерирует команды управления движением и параметры синхронизации лазера и прибора для перемещения предметного столика под лазерным лучом для получения данных МС воксель за вокселем. Последняя версия программного обеспечения, получившая название RastirX, позволяет пользователям рисовать произвольную рентабельность инвестиций на живом видеоизображении образца с помощью компьютерной мыши. Область интереса может быть дополнительно модифицирована сканированием за сканированием, что приводит к значительно более короткому времени сбора данных и меньшему загрязнению веществами вне ткани, чем при использовании прямоугольной области интереса. Этот инструмент произвольной рентабельности инвестиций применялся в нескольких проектах.
С момента своего дебюта в 2006 году компания MALDESI добилась значительных успехов в лазерных технологиях (от УФ-лазеров до различных лазеров с длиной волны среднего ИК-диапазона), настройках ESI и сопутствующем программном обеспечении. Все достижения сделали IR-MALDESI конкурентоспособным инструментом визуализации и прямого анализа для исследования широкого спектра биологических образцов. Связав m / z с положениями, в которых они были получены, можно создать уникальные ионные карты аналитов, которые предоставляют ценную информацию для пространственного распределения липидов, пептидов, метаболомики и других малых биомолекул от образцов млекопитающих до тканей растений.
Подобный ESI процесс позволил MALDESI обнаруживать многозарядные пептиды и белки, что не могло быть реализовано MALDI, потому что MALDI генерирует в основном одно- и двухзарядные ионы.
IR-MALDESI успешно применялся для визуализации распределения липидов на уровне всего тела, а именно у новорожденных мышей и рыбок данио. При использовании метода передискретизации, когда расстояние перемещения предметного столика меньше диаметра лазерного луча, IR-MALDESI MSI на клеточном уровне был достигнут при расстоянии от пятна до пятна ~ 10 микрометров. Более того, липидомная выявляемость IR-MALDESI на уровне отдельной клетки была продемонстрирована на изолированной клетке HeLa.
Помимо мягких тканей (например, яичников курицы и тканей печени крыс), IR-MALDESI способен обнаруживать метаболиты из немодифицированных костей здоровых и пораженных инсультом мышей, встроенных в Plaster of Paris, что приводит к предположительно аннотированным 826 и 669 тканеспецифичным видам..
IR-MALDESI - бесценный инструмент для изучения метаболизма образцов растений и овощей, поскольку эти образцы от природы богаты водой. Недавно IR-MALDESI опубликовала обширный метаболомный анализ томатов черри. При анализе проростков арабидопсиса количество родственных ауксину соединений было относительно количественно определено с использованием меченой стабильным изотопом (SIL) индол-3-уксусной кислоты (IAA). Более того, в этом исследовании агароза использовалась в качестве подходящего субстрата, впервые использованного в IR-MALDESI.
IR-MALDESI продемонстрировал способность измерять выбранные нейротрансмиттеры в мозге крыс, подвергнутых воздействию огнестойкого тетрабромбисфенола А без какой-либо химической дериватизации. Последующая работа, которая была сосредоточена на нейротрансмиттерах и метаболитах, связанных с их путями, в срезах плаценты крыс, сообщила о 49 предположительно идентифицированных нейротрансмиттерах и метаболитах.
Гликаны - это структурно сложные молекулы, которые создают множество аналитических проблем. Был представлен прямой анализ N- связанных гликанов из бычьего фетуина с помощью IR-MALDESI как в режиме положительной, так и в отрицательной ионизации, который указывает на то, что IR-MALDESI может быть альтернативным методом для профилирования N- связанных гликанов.
Хотя большинство традиционных 3D-изображений MSI основано на реконструкции 2D-изображений аналитов из серийных срезов, построение 3D-изображений на основе серийных срезов требует много времени и может привести к потере значительной биологической информации. IR-MALDESI - это метод, основанный на абляции, который позволяет измерять и генерировать трехмерные тепловые карты биомолекул из фармацевтических таблеток и голой кожи мышей путем последовательной визуализации образца с последовательными событиями абляции.
В исследовании, подтверждающем концепцию, антиретровирусные препараты против ВИЧ в инкубированных тканях шейки матки были визуализированы и количественно оценены с помощью IR-MALDESI, а результаты были оценены с помощью утвержденного метода LC-MS / MS. До сих пор фармацевтическое применение IR-MALDESI простиралось от срезов тканей до отдельных прядей волос.
Текстильные волокна - важная форма следствия для уголовного расследования. Одной из характеристик волокон, по которой можно отличить жертву от подозреваемого, является цвет, создаваемый красителем волокна и связанными с ним примесями. Прямой анализ красителя из ткани был успешно проведен с помощью IR-MALDESI без предварительного разделения с помощью хроматографии.
Существуют и другие гибридные методы ионизации, которые сочетают резонансную или нерезонансную лазерную десорбцию с ионизацией электрораспылением. Одним из примеров является лазерная десорбционная ионизация с электрораспылением (ELDI), в которой используется ультрафиолетовый лазер для образования ионов путем прямого облучения образца с последующим взаимодействием с факелом электрораспыления без использования каких-либо матриц. Инфракрасная версия ELDI получила название лазерной абляции с ионизацией электрораспылением (LAESI). IR-MALDESI отличается от этих двух методов тем, что матрица экзогенного льда используется для улучшения десорбции образца, а также геометрических параметров источника. Другой метод, десорбционная фотоионизация при атмосферном давлении (DAPPI), использует струю нагретого пара растворителя для десорбции аналитов с поверхности образца с помощью микрочипа небулайзера. Затем десорбированные молекулы ионизируются фотонами, испускаемыми УФ-лампой, и вводятся в масс-спектрометры.
