Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия

редактировать

Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия (FCCS ) была представлена Эйгеном и Риглер в 1994 году и экспериментально реализованный Швиллем в 1997 году. Это, по сути, расширение процедуры корреляционной спектроскопии флуоресценции (FCS) за счет использования двух разноокрашенных молекул вместо один. Другими словами, совпадающие зеленые и красные флуктуации интенсивности отдельных молекул коррелируют, если зеленые и красные помеченные частицы движутся вместе через заранее заданный конфокальный объем. В результате FCCS обеспечивает высокочувствительное измерение молекулярных взаимодействий независимо от скорости диффузии. Это важное достижение, учитывая, что скорость диффузии слабо зависит от размера молекулярного комплекса.

Рисунок фокусного объема FCCS

FCCS использует два вида, которые независимо помечены двумя флуоресцентными зондами разного цвета. Эти флуоресцентные зонды возбуждаются и обнаруживаются двумя разными источниками лазерного света и детекторами, обычно обозначенными как «зеленый» и «красный». Обычно конфокальный микроскоп используется для получения перекрывающихся зеленого и красного фокусных объемов для возбуждения.

Моделирование FCCS, демонстрирующее невзаимодействующие частицы (слева) и смесь взаимодействующих и независимых частиц (справа)

Нормализованная функция взаимной корреляции определена для двух флуоресцентных частиц $G {\ displaystyle \ G}$ $\ G$ и $R {\ displaystyle \ R}$ $\ R$ , которые являются независимыми каналами зеленого, G и красного, R, следующим образом:

$GGR (τ) = 1 + ⟨δ IG ( t) δ IR (t + τ)⟩ ⟨IG (t)⟩ ⟨IR (t)⟩ = ⟨IG (t) IR (t + τ)⟩ ⟨IG (t)⟩ ⟨IR (t)⟩ {\ displaystyle \ G_ {GR} (\ tau) = 1 + {\ frac {\ langle \ delta I_ {G} (t) \ delta I_ {R} (t + \ tau) \ rangle} {\ langle I_ {G} (t) \ rangle \ langle I_ {R} (t) \ rangle}} = {\ frac {\ langle I_ {G} (t) I_ {R} (t + \ tau) \ rangle} {\ langle I_ {G} ( t) \ rangle \ langle I_ {R} (t) \ rangle}}}$ ${\ displaystyle \ G_ {GR} (\ tau) = 1 + {\ frac {\ langle \ delta I_ {G} (t) \ delta I_ {R } (t + \ tau) \ rangle} {\ langle I_ {G} (t) \ rangle \ langle I_ {R} (t) \ rangle}} = {\ frac {\ langle I_ {G} (t) I_ { R} (t + \ tau) \ rangle} {\ langle I_ {G} (t) \ rangle \ langle I_ {R} (t) \ rangle}}}$

где дифференциальные флуоресцентные сигналы $δ IG {\ displaystyle \ \ delta I_ {G}}$ ${\ displaystyle \ \ delta I_ { G}}$ при определенном время, $t {\ displaystyle \ t}$ $\ t$ и $δ IR {\ displaystyle \ \ delta I_ {R}}$ ${\ displaystyle \ \ delta I_ {R}}$ во время задержки, $τ {\ displaystyle \ \ tau}$ $\ \ тау$ позже коррелирует друг с другом. В отсутствие спектрального просвечивания функция взаимной корреляции равна нулю для невзаимодействующих частиц. В отличие от FCS, функция взаимной корреляции увеличивается с увеличением числа взаимодействующих частиц.

FCCS в основном используется для измерения биомолекулярных взаимодействий как в живых клетках, так и in vitro. Его можно использовать для измерения простых молекулярных стехиометрий и констант связывания. Это один из немногих методов, который может предоставить информацию о белок-белковых взаимодействиях в определенное время и в определенном месте в пределах живой клетки. В отличие от резонансного переноса энергии флуоресценции, он не имеет ограничения расстояния для взаимодействий. В результате его можно использовать для исследования больших комплексов. Тем не менее, для этого требуется, чтобы комплексы активно диффундировали через фокус микроскопа в относительно коротком временном масштабе (обычно секунды).

Содержание

1 Моделирование
2 См. Также
3 Ссылки
4 Внешние ссылки

Моделирование

Кривые взаимной корреляции моделируются в соответствии с несколько более сложной математической функцией чем применяется в FCS. Прежде всего, эффективный наложенный объем наблюдения, в котором каналы G и R образуют единый объем наблюдения, $V eff, RG {\ displaystyle \ V_ {eff, RG}}$ ${\ displaystyle \ V_ {eff, RG}}$ в решении:

$В эфф, RG знак равно π 3/2 (ω ху, G 2 + ω ху, R 2) (ω z, G 2 + ω z, R 2) 1/2/2 3/2 {\ displaystyle \ V_ {eff, RG} = \ pi ^ {3/2} (\ omega _ {xy, G} ^ {2} + \ omega _ {xy, R} ^ {2}) (\ omega _ {z, G } ^ {2} + \ omega _ {z, R} ^ {2}) ^ {1/2} / 2 ^ {3/2}}$ ${\ displaystyle \ V_ {eff, RG} = \ pi ^ {3/2} (\ omega _ {xy, G} ^ {2} + \ omega _ {xy, R} ^ {2}) (\ omega _ {z, G} ^ {2} + \ omega _ {z, R} ^ {2}) ^ {1/2} / 2 ^ {3/2}}$

где $ω xy, G 2 {\ displaystyle \ \ omega _ {xy, G} ^ {2}}$ ${\ displaystyle \ \ omega _ {ху, G} ^ {2} }$ и $ω xy, R 2 {\ displaystyle \ \ omega _ {xy, R} ^ {2}}$ ${ \ Displaystyle \ \ omega _ {ху, R} ^ {2}}$ являются радиальными параметрами, а $ω z, G {\ displaystyle \ \ omega _ {z, G}}$ ${\ displaystyle \ \ omega _ {z, G}}$ и $ω z, R {\ displaystyle \ \ omega _ {z, R }}$ ${\ displaystyle \ \ omega _ {z, R}}$ - аксиальные параметры для каналов G и R соответственно.

Время диффузии, $τ D, GR {\ displaystyle \ \ tau _ {D, GR}}$ ${\ displaystyle \ \ tau _ {D, GR}}$ для дважды (G и R) флуоресцентных частиц, поэтому описывается как следует:

$τ D, GR = ω xy, G 2 + ω xy, R 2 8 DGR {\ displaystyle \ \ tau _ {D, GR} = {\ frac {\ omega _ {xy, G} ^ { 2} + \ omega _ {xy, R} ^ {2}} {8D_ {GR}}}}$ ${\ displaystyle \ \ tau _ {D, GR} = {\ frac {\ omega _ { xy, G} ^ {2} + \ omega _ {xy, R} ^ {2}} {8D_ {GR}}}}$

где $DGR {\ displaystyle \ D_ {GR}}$ ${\ displaystyle \ D_ {GR}}$ - это распространение коэффициент дважды флуоресцентной частицы.

Кривая взаимной корреляции, полученная при диффузии дважды меченых флуоресцентных частиц, может быть смоделирована в отдельных каналах следующим образом:

$GG (τ) = 1 + (< C G>D iffk (τ) + < C G R>D iffk (τ)) V эфф, GR (< C G>+ < C G R>) 2 {\ displaystyle \ G_ {G} (\ tau) = 1 + {\ frac {(Diff_ {k} (\ tau) + Diff_ {k} (\ tau))} {V_ {eff, GR} (+) ^ {2}}}}$ $\ G_{G}(\tau)=1+{\frac {(<C_{G}>Diff_ {k} (\ tau) + <C_{GR}>Diff_ {k} (\ tau))} {V_ {eff, GR} (<C_{G}>+ <C_{GR}>) ^ {2}}}$

$GR (τ) = 1 + (< C R>D iffk (τ) + < C G R>D iffk (τ)) V eff, GR (< C R>+ < C G R>) 2 {\ displaystyle \ G_ {R} (\ tau) = 1 + {\ frac {(Diff_ {k} (\ tau) + Diff_ {k} (\ tau))} {V_ {eff, GR} (+) ^ {2}}}}$ $\ G_{R}(\tau)=1+{\frac {(<C_{R}>Diff_ {k} (\ tau) + <C_{GR}>Diff_ {k} (\ tau))} {V_ {eff, GR} (<C_{R}>+ <C_{GR}>) ^ {2}}}$

В идеальном случае функция взаимной корреляции пропорциональна концентрации дважды меченого флуоресцентного комплекса:

$GGR (τ) = 1 + < C G R>D, если GR (τ) V eff (< C G>+ < C G R>) (< C R>+ < C G R>) {\ displaystyle \ G_ {GR} (\ tau) = 1 + {\ frac {Diff_ {GR} (\ tau)} { V_ {eff} (+)(+)}}}$ $\ G_{GR}(\tau)=1+{\frac {<C_{GR}>Diff_ {GR} (\ tau)} {V_ {eff} (<C_{G}>+<C_{GR}>)(<C_{R}>+<C_{GR}>)}}$

с $D iffk (τ) = 1 (1 + τ τ D, я) (1 + a - 2 (τ τ D, я) 1/2 {\ displaystyle \ Diff_ {k} (\ tau) = {\ frac {1} {(1 + {\ frac { \ tau} {\ tau _ {D, i}}}) (1 + a ^ {- 2} ({\ frac {\ tau} {\ tau _ {D, i}}}) ^ {1/2} }}}$ ${\ displa ystyle \ Diff_ {k} (\ tau) = {\ frac {1} {(1 + {\ frac {\ tau} {\ tau _ {D, i}}}) (1 + a ^ {- 2} ( {\ гидроразрыва {\ тау} {\ тау _ {D, я}}}) ^ {1/2}}}}$

Амплитуда взаимной корреляции прямо пропорциональна концентрации двухкомпонентных (красных и зеленых) частиц

См. Также

Ссылки

Внешние ссылки

Перекрестная корреляция флуоресценции на (FCCS) (Becker Hickl GmbH, веб-страница)