Гибридизация колоний

Процесс гибридизации колоний: рост колоний клеток, репликация на фильтре, гибридизация и идентификация желаемых колоний.

Гибридизация колоний - это метод отбора бактериальных колоний с желаемые гены. Этот метод был открыт Майклом Грюнштейном и Дэвидом С. Хогнессом..

Гибридизация колоний начинается с культивирования малонаселенных бактериальных колоний на чашке с питательным агаром. Эти колонии симметрично реплицируются на фильтре нитроцеллюлоза путем прямого контакта, после чего клетки на мембране фильтра лизируются, а их ДНК денатурируется, что позволяет им размножаться. привязать к фильтру. Эти кластеры ДНК затем гибридизуют с желаемым зондом с радиоактивной меткой РНК или ДНК (выбранным заранее) и подвергают скринингу с помощью авторадиографии. Кластеры ДНК, которые демонстрируют желаемый ген, затем сопоставляются с соответствующими (живыми) бактериальными колониями, которые могут быть изолированы для дальнейшего роста и экспериментов.

.

Определение гибридизации колоний: - Гибридизация колоний - это «метод блот-анализа», в котором бактериальные клетки переносятся с твердой питательной среды на абсорбирующий материал. Гибридизацию колоний можно определить как метод выделения конкретных последовательностей ДНК или генов из бактериальных клеток, содержащих гибридную ДНК, с помощью нитроцеллюлозного мембранного фильтра. Затем передающая среда проходит несколько химических и физических обработок.

Переносящая среда для гибридизации колоний: - Нитроцеллюлозная фильтровальная бумага является переносящей средой для гибридизации колоний, которая образует копии эталонного планшета. Нитроцеллюлоза действует как мембрана, которая содержит точные копии гена эталонной пластины. Нитроцеллюлозная фильтровальная бумага действует как «промокательная прокладка».

Гибридизация колоний включает следующие этапы:

Подготовка мастер-планшета: - Сначала инокулируют суспензию бактериальных клеток на твердой агаризованной среде для приготовления мастер-планшета. После инокуляции количество бактериальных колоний будет развиваться с различными плазмидами, которые называют «эталонной или контрольной чашкой».

Формирование реплик на нитроцеллюлозном фильтре: - Затем перенесите бактериальные клетки с мастер-планшета на мембрану или отфильтруйте с помощью «нитроцеллюлозного фильтра». Прижмите нитроцеллюлозную фильтровальную бумагу к поверхности мастер-планшета. Это сжатие фильтрующей мембраны будет формировать реплики или копии бактериальных клеток, как на мастер-планшете.

Обработка фильтрующей среды SDS: - После этого обработайте нитроцеллюлозную фильтровальную бумагу детергентом, таким как SDS (додецилсульфат натрия), чтобы лизировать бактериальные клетки.

Обработка фильтрующей среды щелочью: - Обработайте фильтрующую среду щелочью, например гидроксидом натрия, чтобы разделить ДНК на отдельные нити.

Фиксация ДНК на фильтрующей среде: - Чтобы зафиксировать ДНК на нитроцеллюлозной фильтровальной бумаге, либо запекайте фильтровальную бумагу при температуре 80 градусов Цельсия, либо подвергайте ее воздействию ультрафиолетового света.

Добавление радиоактивного зонда: - Гибридизируйте нитроцеллюлозную фильтровальную бумагу, содержащую отпечатки плазмидной ДНК, путем добавления радиоактивного зонда РНК. Этот радиоактивный РНК-зонд будет кодировать желаемую последовательность гена из бактериальных клеток.

Промывка и авторадиография: - Промойте фильтровальную бумагу, чтобы удалить несвязанные частицы зонда. После этого выставьте нитроцеллюлозную фильтровальную бумагу на рентгеновскую пленку методом, называемым «Авторадиография». Колония, которая появится после авторадиографии, будет называться «авторадиограммой», которая несет интересующие гены.

Идентификация желаемого гена: - Затем сравните полученную авторадиограмму с мастер-планшетом, чтобы идентифицировать колонии, содержащие интересующий ген.

Клетки, которые содержат желаемый ген, могут расти в жидкой среде и могут дополнительно обрабатываться для выделения рекомбинантной плазмидной ДНК.

Заключение: - Таким образом, мы можем сделать вывод, что метод гибридизации колоний - это «метод скрининга», в котором используется радиоактивный зонд. Затем радиоактивно меченый зонд скринирует или изолирует конкретный ген из числа бактериальных колоний.

.