Войти
Периодическая противоточная хроматография (PCC) - это метод проведения аффинной хроматографии квазинепрерывным образом. Сегодня этот процесс в основном используется для очистки антител в биофармацевтической промышленности, а также в исследованиях и разработках. При очистке антител протеин A используется в качестве аффинной матрицы. Однако периодические противоточные процессы могут применяться к любой хроматографии аффинного типа.
В обычной аффинной хроматографии в одну хроматографическую колонку загружают исходный материал до точки, до которой целевой материал (продукт) больше не может удерживаться аффинным материалом. Затем смолу с адсорбированным продуктом промывают для удаления примесей. Наконец, чистый продукт элюируют другим буфером. Примечательно, что если в колонну загружается слишком много исходного материала, продукт может прорваться, и, следовательно, продукт будет потерян. Поэтому очень важно загружать колонку лишь частично, чтобы увеличить урожай.
Схема процесса для 2-колоночного периодического противоточного процесса "CaptureSMB". Периодическая противоточная хроматография решает эту проблему за счет использования более чем одной колонки. Процессы PCC можно запускать с любым количеством столбцов, начиная с двух. В следующем абзаце будет объяснена версия PCC с двумя столбцами, но другие протоколы с большим количеством столбцов основываются на тех же принципах (см. Ниже). Диаграмма, изображающая отдельные этапы процесса, показана справа. На этапе 1, так называемой фазе последовательной загрузки, столбцы 1 и 2 соединяются между собой. Колонка 1 полностью загружена образцом (красный), в то время как его прорыв фиксируется на колонке 2. На этапе 2 колонка 1 промывается, элюируется, очищается и повторно уравновешивается, в то время как загрузка продолжается отдельно в колонку 2. На этапе 3 после регенерации В колонке 1 колонки снова соединены между собой, и колонка 2 полностью загружена, в то время как ее проскок фиксируется на колонке 1. Наконец, на этапе 4 колонка 2 промывается, элюируется, очищается и повторно уравновешивается, при этом загрузка продолжается независимо от колонки 1. Этот циклический процесс повторяется непрерывно.
Существует несколько вариантов периодической противоточной хроматографии с более чем двумя колонками. В этих случаях дополнительные столбцы помещаются в поток питания во время загрузки, что дает тот же эффект, что и использование более длинных столбцов. В качестве альтернативы, дополнительные колонки могут оставаться в незанятом режиме ожидания во время загрузки. Этот режим дает дополнительную уверенность в том, что на основной процесс не влияют протоколы мойки и очистки, хотя на практике это требуется редко. С другой стороны, недостаточно используемые колонны снижают теоретическую максимальную производительность для таких процессов. В целом, преимущества и недостатки различных многоколоночных протоколов являются предметом споров. Однако, несомненно, по сравнению с периодическими процессами с одной колонной, периодические противоточные процессы значительно повышают производительность.
Механизмы динамического управления процессом для периодической противоточной хроматографии. На шкале времени непрерывной хроматографии довольно часто можно наблюдать изменения важных параметров процесса, таких как колонка здоровье, качество буфера, титр (концентрация) корма или состав корма. Такие изменения приводят к изменению максимальной производительности колонки по отношению к количеству загруженного исходного материала. Поэтому для достижения стабильного качества и выхода продукции для каждого технологического цикла необходимо отрегулировать время отдельных этапов процесса. Ручные изменения в принципе возможны, но непрактичны. Чаще всего алгоритмы динамического управления процессом контролируют параметры процесса и автоматически вносят необходимые изменения.
В настоящее время используются два различных режима работы динамических контроллеров процесса (см. Рисунок справа). Первый, называемый DeltaUV, отслеживает разницу между двумя сигналами от детекторов, расположенных до и после первого столбца. Во время начальной загрузки разница между двумя сигналами большая, но она уменьшается по мере того, как примеси проходят через колонку. Когда колонка полностью насыщена примесями и задерживается только дополнительный продукт, разница между сигналами достигает постоянного значения. Пока продукт полностью улавливается в столбце, разница между сигналами остается постоянной. Как только часть продукта выходит из столбца (сравните выше), разница уменьшается. Таким образом, можно определить время и количество прорыва продукта. Вторая возможность, называемая AutomAb, требует только сигнала одного детектора, расположенного за первой колонкой. Во время начальной загрузки сигнал увеличивается, поскольку все больше и больше примесей проникают через колонку. Когда колонка насыщена примесями и пока продукт полностью улавливается колонкой, сигнал остается постоянным. Как только часть продукта прорывается через столбик (сравните выше), сигнал снова увеличивается. Таким образом, можно снова определить время и количество прорыва продукта.
Обе итерации одинаково хорошо работают в теории. На практике требование двух синхронизированных сигналов и воздействия на один детектор неочищенного исходного материала делает подход DetaUV менее надежным, чем AutomAb.
По состоянию на 2017 год GE Healthcare имеет патенты на трехколоночную периодическую противоточную хроматографию: эта технология используется в их Äkta PCC инструмент. Аналогичным образом ChromaCon имеет патенты на оптимизированную версию с двумя столбцами (CaptureSMB). CaptureSMB используется в Contichrom CUBE и по лицензии в системах Ecoprime Twin YMC. Дополнительные производители систем, способных к периодической противоточной хроматографии, включают и Pall.
