Перевод ников

Перевод ников (или перевод заголовка ), разработанный в 1977 году Питером Ригби и Полом Бергом, представляет собой метод тегирования в молекулярной биологии, в котором ДНК-полимераза I используется для замены некоторых нуклеотидов последовательности ДНК их мечеными аналогами, создавая меченую последовательность ДНК, которую можно использовать в качестве зонда в флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) или блоттинг техники. Его также можно использовать для радиоактивной метки.

. Этот процесс называется ник-трансляцией, поскольку обрабатываемая ДНК обрабатывается ДНКазой для образования однонитевых «разрывов». После этого следует замена в разорванных сайтах ДНК-полимеразой I, которая удлиняет 3 'гидроксильный конец, удаляя нуклеотиды за счет 5'-3' экзонуклеазной активности, заменяя их на dNTP. Чтобы радиоактивно пометить фрагмент ДНК для использования в качестве зонда в процедурах блоттинга, один из включенных в реакцию нуклеотидов метят радиоактивным изотопом в альфа-фосфатном положении. Точно так же вместо флуорофора можно присоединить для флуоресцентного мечения или антиген для иммунодетекции. Когда ДНК-полимераза I в конечном итоге отделяется от ДНК, она оставляет еще одну щель в фосфатном остове. Ник "переместился" на некоторое расстояние в зависимости от процессивности полимеразы. Эта щель может быть закрыта ДНК-лигазой, или ее 3'-гидроксильная группа может служить матрицей для дальнейшей активности ДНК-полимеразы I. Запатентованные смеси ферментов коммерчески доступны для выполнения всех этапов процедуры за одну инкубацию.

Трансляция по нику может вызвать разрывы двухцепочечной ДНК, если ДНК-полимераза I встречает другой разрыв на противоположной цепи, в результате чего образуются два более коротких фрагмента. Это не влияет на характеристики меченого зонда при гибридизации in situ.

.