Двухгибридный скрининг

редактировать

Обзор двухгибридного анализа, проверяющего взаимодействия между двумя белками, называемыми здесь Bait и Prey.. Ген фактора транскрипции Gal4 продуцирует двухдоменный белок ( BD и AD), необходимый для транскрипции репортерного гена ( LacZ). В, С. Готовят два слитых белка: Gal4BD + Bait и Gal4AD + Prey. Ни одного из них обычно недостаточно для инициации транскрипции (репортерного гена) в одиночку. D. Когда продуцируются оба слитых белка и часть Bait первого слитого белка взаимодействует с частью Prey второго, происходит транскрипция репортерного гена.

Двухгибридный скрининг (первоначально известный как дрожжевая двугибридная система или Y2H) - это метод молекулярной биологии, используемый для обнаружения межбелковых взаимодействий (ИПП) и белок-ДНК путем тестирования физических взаимодействий (таких как связывание) между двумя белками или один белок и молекула ДНК соответственно.

Предпосылка, лежащая в основе теста, - активация нижележащего репортерного гена (ов) путем связывания фактора транскрипции с вышестоящей активирующей последовательностью (UAS). Для двухгибридного скрининга фактор транскрипции разделяется на два отдельных фрагмента, называемых ДНК-связывающим доменом (DBD или часто также сокращенно BD) и активирующим доменом (AD). BD - это домен, ответственный за связывание с UAS, а AD - это домен, ответственный за активацию транскрипции. Таким образом, Y2H представляет собой анализ комплементации белковых фрагментов.

СОДЕРЖАНИЕ

  • 1 История
  • 2 Основная предпосылка
  • 3 фиксированных домена
  • 4 Конструирование экспрессионных плазмид
    • 4.1 Особенности E. coli
  • 5 Восстановление информации о белках
    • 5.1 E. coli
  • 6 Контроль чувствительности
  • 7 Неслитые белки
  • 8 Сплит-убиквитин дрожжевой двугибридный
  • 9 Флуоресцентный двухгибридный анализ
  • 10 Ферментативные двугибридные системы: KISS
  • 11 Одно-, трех- и одно- двухгибридные варианты
    • 11.1 Одногибридный
    • 11.2 Трехгибридный
    • 11.3 Одн-двугибридный
  • 12 Организм-хозяин
    • 12.1 S. cerevisiae (дрожжи)
    • 12.2 Candida albicans
    • 12.3 E. coli
    • 12.4 Клетки млекопитающих
    • 12.5 Arabidopsis thaliana
    • 12.6 Аплизия калифорнийская
    • 12.7 Bombyx mori
  • 13 приложений
    • 13.1 Определение последовательностей, важных для взаимодействия
    • 13.2 Открытие наркотиков и ядов
    • 13.3 Определение функции белка
    • 13.4 Выбор белков цинкового пальца
  • 14 сильных сторон
  • 15 Слабых мест
  • 16 См. Также
  • 17 Ссылки
  • 18 Внешние ссылки

История

Метод, впервые примененный Стэнли Филдсом и Ок-Кю Сонгом в 1989 году, был первоначально разработан для обнаружения межбелковых взаимодействий с использованием активатора транскрипции Gal4 дрожжевых Saccharomyces cerevisiae. Gal4 белка активировать транскрипцию гена, участвующего в галактозы использования, которые легли в основу отбора. С тех пор тот же принцип был адаптирован для описания многих альтернативных методов, включая те, которые обнаруживают взаимодействия белок-ДНК или взаимодействия ДНК-ДНК, а также методы, в которых вместо дрожжей используются различные организмы-хозяева, такие как Escherichia coli или клетки млекопитающих.

Основное помещение

Ключ к двугибридному скринингу заключается в том, что в большинстве факторов транскрипции эукариот активирующий и связывающий домены являются модульными и могут функционировать в непосредственной близости друг от друга без прямого связывания. Это означает, что даже несмотря на то, что фактор транскрипции разделен на два фрагмента, он все еще может активировать транскрипцию, когда два фрагмента косвенно связаны.

Наиболее распространенным подходом к скринингу является двухгибридный анализ дрожжей. При таком подходе исследователь знает, где находится каждая жертва на используемой среде (чашках с агаром). Миллионы потенциальных взаимодействий в нескольких организмах были проверены за последнее десятилетие с использованием высокопроизводительных систем скрининга (часто с использованием роботов), и более тысячи взаимодействий были обнаружены и классифицированы в базах данных как BioGRID. В этой системе часто используется генетически модифицированный штамм дрожжей, в котором отсутствует биосинтез определенных питательных веществ (обычно аминокислот или нуклеиновых кислот ). При выращивании на среде, в которой отсутствуют эти питательные вещества, дрожжи не выживают. Этот мутантный штамм дрожжей можно заставить включать чужеродную ДНК в форме плазмид. При двухгибридном скрининге дрожжей отдельные плазмиды-приманки и жертвы одновременно вводятся в мутантный штамм дрожжей или используется стратегия скрещивания для получения обеих плазмид в одной клетке-хозяине.

Второй подход с высокой пропускной способностью - это подход скрининга библиотек. В этом случае клетки наживки и жертвы спариваются в случайном порядке. После скрещивания и отбора выживших клеток на селективной среде ученый секвенирует выделенные плазмиды, чтобы увидеть, какая жертва (последовательность ДНК) взаимодействует с использованной приманкой. Этот подход имеет более низкую воспроизводимость и имеет тенденцию давать большее количество ложных срабатываний по сравнению с матричным подходом.

Плазмиды конструируются для производства белкового продукта, в котором фрагмент ДНК-связывающего домена (BD) слит с белком, в то время как другая плазмида конструируется для получения белкового продукта, в котором фрагмент домена активации (AD) слит с другим белком. Белок, слитый с BD, может называться белком-приманкой, и обычно это известный белок, который исследователь использует для идентификации новых партнеров по связыванию. Белок, слитый с AD, может называться белком жертвы и может быть либо отдельным известным белком, либо библиотекой известных или неизвестных белков. В этом контексте библиотека может состоять из набора последовательностей, кодирующих белок, которые представляют все белки, экспрессируемые в конкретном организме или ткани, или может быть создана путем синтеза случайных последовательностей ДНК. Независимо от источника, они впоследствии включаются в кодирующую белок последовательность плазмиды, которая затем трансфицируется в клетки, выбранные для метода скрининга. Этот метод при использовании библиотеки предполагает, что каждая клетка трансфицирована не более чем одной плазмидой и что, следовательно, каждая клетка в конечном итоге экспрессирует не более одного члена из белковой библиотеки.

Если белки наживки и жертвы взаимодействуют (т. Е. Связываются), то AD и BD фактора транскрипции косвенно связаны, в результате чего AD приближается к сайту начала транскрипции, и может происходить транскрипция репортерного гена (ов). Если два белка не взаимодействуют, транскрипция репортерного гена отсутствует. Таким образом, успешное взаимодействие между слитым белком связано с изменением фенотипа клетки.

Проблема отделения клеток, которые экспрессируют белки, которые взаимодействуют со своими слитными белками, от тех, которые этого не делают, рассматривается в следующем разделе.

Фиксированные домены

В любом исследовании некоторые из исследуемых белковых доменов будут варьироваться в соответствии с целями исследования, тогда как другие домены, которые сами не исследуются, будут оставаться постоянными. Например, в двухгибридном исследовании для выбора ДНК-связывающих доменов ДНК-связывающий домен, BD, будет варьироваться, в то время как два взаимодействующих белка, приманка и жертва, должны оставаться постоянными для поддержания прочного связывания между BD. и AD. Есть несколько доменов, из которых можно выбрать BD, приманку, добычу и AD, если они должны оставаться постоянными. В исследованиях межбелкового взаимодействия BD может быть выбран из любого из многих сильных ДНК-связывающих доменов, таких как Zif268. Частым выбором доменов приманки и жертвы являются остатки 263–352 дрожжевого Gal11P с мутацией N342V и остатки 58–97 дрожжевого Gal4, соответственно. Эти домены могут использоваться как в методах селекции на основе дрожжей, так и бактерий, и, как известно, они прочно связываются друг с другом.

Выбранный AD должен быть способен активировать транскрипцию репортерного гена с использованием собственного транскрипционного аппарата клетки. Таким образом, разнообразие AD, доступных для использования в методах на основе дрожжей, может не подходить для использования в их аналогах на основе бактерий. AD, VP16 и дрожжевой Gal4 AD, полученные из вируса простого герпеса, успешно применялись в дрожжах, в то время как часть α-субъединицы РНК-полимеразы E. coli была использована в методах, основанных на E. coli.

В то время как сильно активирующие домены могут обеспечить большую чувствительность к более слабым взаимодействиям, наоборот, более слабая AD может обеспечить большую строгость.

Конструирование экспрессионных плазмид

Ряд сконструированных генетических последовательностей должен быть включен в клетку-хозяин для выполнения двухгибридного анализа или одного из его производных методов. Соображения и методы, используемые при конструировании и доставке этих последовательностей, различаются в зависимости от потребностей анализа и организма, выбранного в качестве экспериментального фона.

Есть две широкие категории гибридных библиотек: случайные библиотеки и библиотеки на основе кДНК. Библиотеку кДНК состоит из кДНК получают посредством обратной транскрипции мРНК собирали из специфических клеток типов клеток. Эту библиотеку можно лигировать в конструкцию, чтобы она была прикреплена к BD или AD, используемым в анализе. Случайная библиотека использует длины ДНК случайной последовательности вместо этих участков кДНК. Существует ряд методов получения этих случайных последовательностей, включая кассетный мутагенез. Независимо от источника библиотеки ДНК, ее лигируют в соответствующее место в соответствующей плазмиде / фагмиде с использованием соответствующих эндонуклеаз рестрикции.

Особенности E. coli

Помещая гибридные белки под контроль IPTG- индуцируемых lac- промоторов, они экспрессируются только на средах с добавлением IPTG. Кроме того, путем включения различных генов устойчивости к антибиотикам в каждую генетическую конструкцию рост нетрансформированных клеток легко предотвращается путем культивирования на средах, содержащих соответствующие антибиотики. Это особенно важно для методов встречного отбора, в которых для выживания клеток необходимо отсутствие взаимодействия.

Репортерный ген может быть вставлен в геном E. coli, сначала вставив его в эписому, тип плазмиды со способностью встраиваться в геном бактериальной клетки с числом копий приблизительно одна на клетку.

Гибридные экспрессионные фагмиды могут быть электропорированы в клетки E. coli XL-1 Blue, которые после амплификации и инфицирования фагом - помощником VCS-M13 будут давать запас библиотечного фага. Каждый из этих фагов будет содержать по одному одноцепочечному члену библиотеки фагмид.

Восстановление информации о белках

После того, как отбор произведен, необходимо определить первичную структуру белков, которые обладают соответствующими характеристиками. Это достигается путем извлечения кодирующих белок последовательностей (в том виде, в каком они были изначально вставлены) из клеток, демонстрирующих соответствующий фенотип.

Кишечная палочка

Фагмида, используемая для трансформации клеток E. coli, может быть «освобождена» от выбранных клеток путем инфицирования их фагом-помощником VCS-M13. Полученные в результате фаговые частицы содержат одноцепочечные фагмиды и используются для инфицирования клеток XL-1 Blue. Двухцепочечные фагмиды впоследствии собирают из этих клеток XL-1 Blue, по существу обращая процесс, использованный для получения исходного библиотечного фага. Наконец, последовательности ДНК определяют с помощью дидезокси-секвенирования.

Контроль чувствительности

В кишечной палочке -derived Tet-R репрессор может быть использована в соответствии с обычным геном - репортером и может управляться с помощью тетрациклина или доксициклина (ингибиторы Tet-R). Таким образом, экспрессия Tet-R контролируется стандартной двугибридной системой, но Tet-R, в свою очередь, контролирует (репрессирует) экспрессию ранее упомянутого репортера, такого как HIS3, через свой промотор Tet-R. Затем тетрациклин или его производные можно использовать для регулирования чувствительности системы, использующей Tet-R.

Чувствительность также можно контролировать, варьируя зависимость клеток от их репортерных генов. Например, на это может повлиять изменение концентрации гистидина в среде роста для his3- зависимых клеток и изменение концентрации стрептомицина для aadA- зависимых клеток. Зависимость от селекционного гена также можно контролировать, применяя ингибитор селекционного гена в подходящей концентрации. Например, 3-амино-1,2,4-триазол (3-AT) является конкурентным ингибитором продукта гена HIS3 и может использоваться для титрования минимального уровня экспрессии HIS3, необходимого для роста на средах с дефицитом гистидина.

Чувствительность также можно модулировать, варьируя количество операторных последовательностей в репортерной ДНК.

Неслитые белки

Третий, не слитый белок может коэкспрессироваться с двумя слитыми белками. В зависимости от исследования третий белок может модифицировать один из гибридных белков или опосредовать или мешать их взаимодействию.

Совместная экспрессия третьего белка может быть необходима для модификации или активации одного или обоих слитых белков. Например, S. cerevisiae не обладает эндогенной тирозинкиназой. Если в исследовании участвует белок, который требует фосфорилирования тирозина, киназа должна поставляться в форме гена тирозинкиназы.

Неслитый белок может опосредовать взаимодействие путем одновременного связывания обоих слитых белков, как в случае лиганд-зависимой димеризации рецептора.

Для белка с взаимодействующим партнером его функциональную гомологию с другими белками можно оценить, поставив третий белок в неслитой форме, который затем может или не может конкурировать со слитым белком за своего связывающего партнера. Связывание между третьим белком и другим слитым белком будет прерывать образование комплекса активации экспрессии репортера и, таким образом, уменьшать экспрессию репортера, приводя к различимому изменению фенотипа.

Сплит-убиквитиновые дрожжи двугибридные

Одним из ограничений классических дрожжевых двугибридных скринингов является то, что они ограничиваются растворимыми белками. Поэтому их невозможно использовать для изучения белок-белковых взаимодействий между нерастворимыми интегральными мембранными белками. Система сплит-убиквитин обеспечивает способ преодоления этого ограничения. В системе сплит-убиквитин два интегральных мембранных белка, которые должны быть изучены, сливаются с двумя различными частями убиквитина : C-концевой частью убиквитина («Cub», остатки 35–76) и N-концевой частью убиквитина («Nub», остатки 1–34). Эти слитые белки называются приманкой и добычей соответственно. Помимо слияния с интегральным мембранным белком, фрагмент Cub также слит с фактором транскрипции (TF), который может отщепляться убиквитин-специфическими протеазами. При взаимодействии приманка-жертва Nub и Cub-фрагменты собираются, восстанавливая расщепленный убиквитин. Восстановленная молекула расщепленного убиквитина распознается убиквитин-специфическими протеазами, которые отщепляют фактор транскрипции, что позволяет ему индуцировать транскрипцию репортерных генов.

Флуоресцентный двухгибридный анализ

Золгадр и его сотрудники представили флуоресцентную двухгибридную систему, в которой используются два гибридных белка, которые слиты с разными флуоресцентными белками, а также LacI, репрессор lac. Структура гибридных белков выглядит следующим образом: FP2-LacI-bait и FP1-prey, где белки приманки и жертвы взаимодействуют и сближают флуоресцентные белки (FP1 = GFP, FP2 = mCherry ) в месте связывания LacI. белок в геноме клетки-хозяина. Система также может использоваться для скрининга ингибиторов белок-белковых взаимодействий.

Ферментативные двухгибридные системы: KISS

В то время как исходная система Y2H использовала восстановленный фактор транскрипции, другие системы создают ферментативную активность для обнаружения ИПП. Например, датчик субстрата киназы («KISS») представляет собой двухгибридный подход млекопитающих, разработанный для картирования внутриклеточных ИПП. Здесь белок-приманка сливается с киназной частью TYK2, а жертва связывается с фрагментом цитокинового рецептора gp130. Когда приманка и жертва взаимодействуют, TYK2 фосфорилирует сайты стыковки STAT3 на химере жертвы, что в конечном итоге приводит к активации репортерного гена.

Одно-, трех- и одно-двугибридные варианты

Одногибридный

Одногибридный вариант этого метода разработан для исследования взаимодействий белок-ДНК и использует один гибридный белок, в котором AD непосредственно связан со связывающим доменом. Однако связывающий домен в этом случае не обязательно имеет фиксированную последовательность, как в двухгибридном белок-белковом анализе, но может состоять из библиотеки. Эта библиотека может быть выбрана против желаемой целевой последовательности, которая вставлена ​​в промоторную область конструкции репортерного гена. Таким образом, в системе положительного отбора выбирается связывающий домен, который успешно связывает UAS и обеспечивает транскрипцию.

Обратите внимание, что отбор ДНК-связывающих доменов не обязательно выполняется с использованием одногибридной системы, но может также выполняться с использованием двухгибридной системы, в которой связывающий домен варьируется, а белки приманки и жертвы остаются постоянными.

Трехгибридный

Обзор трехгибридного анализа.

РНК-белковые взаимодействия были исследованы с помощью трехгибридного варианта двухгибридного метода. В этом случае гибридная молекула РНК служит для соединения вместе двух доменов слияния белков, которые предназначены не для взаимодействия друг с другом, а скорее с промежуточной молекулой РНК (через свои РНК-связывающие домены). Методы с участием неслитых белков, которые выполняют аналогичную функцию, как описано выше в разделе «неслитые белки», также могут называться трехгибридными методами.

Один-двугибридный

Одновременное использование одно- и двугибридных методов (то есть одновременного взаимодействия белок-белок и белок-ДНК) известно как одно-двухгибридный подход и, как ожидается, повысит строгость проверки.

Организм-хозяин

Хотя теоретически любая живая клетка может быть использована в качестве фона для двугибридного анализа, существуют практические соображения, которые определяют, какой из них выбрать. Выбранная клеточная линия должна быть относительно дешевой, удобной для культивирования и достаточно прочной, чтобы выдерживать применение исследовательских методов и реагентов. Последнее особенно важно для проведения высокопроизводительных исследований. Поэтому дрожжи S. cerevisiae были основным организмом-хозяином для двухгибридных исследований. Однако это не всегда идеальная система для изучения взаимодействующих белков других организмов. Дрожжевые клетки часто не имеют одинаковых посттрансляционных модификаций, имеют другое использование кодонов или не имеют определенных белков, которые важны для правильной экспрессии белков. Чтобы справиться с этими проблемами, было разработано несколько новых двухгибридных систем. В зависимости от используемой системы агаровые чашки или конкретная среда для выращивания используются для выращивания клеток и обеспечения отбора для взаимодействия. Чаще всего используется метод посева на агар, при котором клетки высевают на селективную среду, чтобы увидеть, как происходит взаимодействие. Клетки, не имеющие взаимодействующих белков, не должны выжить в этой селективной среде.

S. cerevisiae (дрожжи)

Дрожжи S. cerevisiae были модельным организмом, использованным во время создания двугибридной техники. Это широко известно как система Y2H. Он имеет несколько характеристик, которые делают его надежным организмом для взаимодействия, в том числе способность образовывать третичные белковые структуры, нейтральный внутренний pH, повышенную способность образовывать дисульфидные связи и глутатион в восстановленном состоянии среди других цитозольных буферных факторов, чтобы поддерживать благоприятный внутренний среда. Моделью дрожжей можно манипулировать с помощью немолекулярных методов, и ее полная последовательность генома известна. Дрожжевые системы толерантны к различным условиям культивирования и агрессивным химическим веществам, которые нельзя применять к культурам тканей млекопитающих.

Ряд штаммов дрожжей был создан специально для скрининга Y2H, например Y187 и AH109, оба производимые Clontech. Также использовались штаммы дрожжей R2HMet и BK100.

грибковые микроорганизмы албиканс

C. albicans - это дрожжи с особой особенностью: они переводят кодон CUG в серин, а не лейцин. Из-за этого различного использования кодонов трудно использовать модельную систему S. cerevisiae в качестве Y2H для проверки белок-белковых взаимодействий с использованиемгенов C. albicans. Чтобы обеспечить более естественную среду обитания,была разработана двугибридная (C2H) система C. albicans. С помощью этой системы белок-белковые взаимодействия можно изучать насамом C. albicans. Недавним дополнением стало создание высокопроизводительной системы.

Кишечная палочка

Бактериальные двухгибридные методы (B2H или BTH) обычно применяются в E. coli и имеют некоторые преимущества перед системами на основе дрожжей. Например, более высокая эффективность трансформации и более высокая скорость роста позволяют E. coli использовать библиотеки большего размера (более 10 8). Отсутствие требований к включению сигнала ядерной локализации в последовательность белка и способность изучать белки, которые были бы токсичными для дрожжей, также могут быть основными факторами, которые следует учитывать при выборе экспериментального фонового организма.

Активность метилирования некоторых белков ДНК-метилтрансферазы E. coli может мешать отбору некоторых ДНК-связывающих белков. Если это ожидается, использование штамма E. coli, дефектного по определенной метилтрансферазе, может быть очевидным решением. B2H может быть не идеальным при изучении эукариотических белок-белковых взаимодействий (например, человеческих белков), поскольку белки могут не складываться, как в эукариотических клетках, или могут не иметь другого процессинга.

Клетки млекопитающих

В последние годы была разработана двухгибридная система млекопитающих (M2H) для изучения белок-белковых взаимодействий млекопитающих в клеточной среде, которая близко имитирует среду нативного белка. В этой системе используются временно трансфицированные клетки млекопитающих для обнаружения белок-белковых взаимодействий. Использование клеточной линии млекопитающих для изучения белок-белковых взаимодействий млекопитающих дает преимущество работы в более естественном контексте. Посттрансляционные модификации, фосфорилирование, ацилирование и гликозилирование аналогичны. Внутриклеточная локализация белков также более правильна по сравнению с использованием дрожжевой двухгибридной системы. С помощью двухгибридной системы млекопитающих также возможно изучать входные сигналы. Еще одним большим преимуществом является то, что результаты можно получить в течение 48 часов после трансфекции.

Arabidopsis thaliana

В 2005 году была разработана двугибридная система растений. Используя протопласты белок-белковых взаимодействий A. thaliana, можно изучать у растений. Таким образом, взаимодействия можно изучать в их естественном контексте. В этой системе GAL4 AD и BD находятся под контролем сильного промотора 35S. Взаимодействие измеряется с помощью репортера GUS. Для обеспечения высокопроизводительного скрининга векторы были сделаны совместимыми со шлюзом. Система известна как протопласт-двухгибридная (P2H) система.

Аплизия калифорнийская

Морской заяц Калифорния является модельным организмом в нейробиологии для изучения молекулярных механизмов долговременной памяти. Для изучения взаимодействий, важных для неврологии, в более естественной среде была разработана двухгибридная система в нейронах A. californica. В этой системе используются GAL4 AD и BD.

Bombyx mori

Двугибридная система насекомых (I2H) была разработана в клеточной линии тутового шелкопряда из личинки или гусеницы одомашненной шелковой моли Bombyx mori (клетки BmN4). Эта система использует GAL4 BD и домен активации NF-κB P65 мыши. Оба находятся под контролем промотора OpIE2.

Приложения

Определение последовательностей, важных для взаимодействия

Изменяя конкретные аминокислоты путем мутации соответствующих пар оснований ДНК в используемых плазмидах, можно определить важность этих аминокислотных остатков для поддержания взаимодействия.

После использования метода на основе бактериальных клеток для выбора ДНК-связывающих белков необходимо проверить специфичность этих доменов, поскольку существует предел того, в какой степени геном бактериальной клетки может действовать как приемник для доменов со сродством к другим последовательности (или, действительно, общее сродство к ДНК).

Открытие наркотиков и ядов

Белковые сигнальные взаимодействия представляют собой подходящие терапевтические цели из-за их специфичности и распространенности. Подход к случайному открытию лекарств использует банки соединений, которые содержат случайные химические структуры, и требует высокопроизводительного метода для тестирования этих структур в их намеченной цели.

Клетка, выбранная для исследования, может быть специально сконструирована так, чтобы отражать молекулярный аспект, который исследователь намеревается изучить, а затем использоваться для идентификации новых терапевтических средств для человека или животных или агентов против вредителей.

Определение функции белка

Путем определения партнеров по взаимодействию неизвестных белков можно сделать вывод о возможных функциях этих новых белков. Это может быть сделано с использованием одного известного белка против библиотеки неизвестных белков или, наоборот, путем выбора из библиотеки известных белков с использованием одного белка с неизвестной функцией.

Выбор белка цинкового пальца

Чтобы выбрать белки с цинковыми пальцами (ZFP) для белковой инженерии, с успехом были использованы методы, адаптированные из метода двухгибридного скрининга. ZFP сам по себе является ДНК-связывающим белком, используемым для создания заказных ДНК-связывающих доменов, которые связываются с желаемой последовательностью ДНК.

Используя ген отбора с желаемой целевой последовательностью, включенной в UAS, и рандомизируя соответствующие аминокислотные последовательности для получения библиотеки ZFP, можно выбрать клетки, в которых происходит взаимодействие ДНК-ZFP с требуемыми характеристиками. Каждый ZFP обычно распознает только 3–4 пары оснований, поэтому для предотвращения распознавания сайтов за пределами UAS рандомизированный ZFP конструируется в «каркас», состоящий из еще двух ZFP с постоянной последовательностью. Таким образом, UAS предназначен для включения целевой последовательности постоянного каркаса в дополнение к последовательности, для которой выбран ZFP.

С помощью этой системы также можно исследовать ряд других ДНК-связывающих доменов.

Сильные стороны

  • Двухгибридные экраны низкотехнологичны; их можно проводить в любой лаборатории без сложного оборудования.
  • Двухгибридные экраны могут дать важную первую подсказку для идентификации партнеров по взаимодействию.
  • Анализ масштабируем, что позволяет проводить скрининг взаимодействий между многими белками. Кроме того, это можно автоматизировать, и с помощью роботов можно провести скрининг многих белков против тысяч потенциально взаимодействующих белков за относительно короткое время. Используются два типа больших экранов: библиотечный подход и матричный подход.
  • Данные о двугибридных дрожжах могут быть такого же качества, что и данные, полученные с помощью альтернативного подхода коаффинной очистки с последующей масс-спектрометрией (AP / MS).

Недостатки

  • Основная критика дрожжевого двугибридного скрининга белок-белковых взаимодействий заключается в возможности большого количества ложноположительных (и ложноотрицательных) идентификаций. Точная частота ложноположительных результатов неизвестна, но более ранние оценки доходили до 70%. Это также частично объясняет часто обнаруживаемое очень небольшое совпадение результатов при использовании (высокой пропускной способности) двухгибридного скрининга, особенно при использовании различных экспериментальных систем.

Причина такого высокого количества ошибок кроется в характеристиках экрана:

  • Некоторые варианты анализа сверхэкспрессируют слитые белки, что может вызывать неестественные концентрации белка, которые приводят к неспецифическим (ложным) положительным результатам.
  • Гибридные белки представляют собой гибридные белки; то есть слитые части могут ингибировать определенные взаимодействия, особенно если взаимодействие происходит на N-конце тестового белка (где обычно прикрепляется ДНК-связывающий или активирующий домен).
  • Взаимодействие может не происходить в дрожжах, типичном организме-хозяине Y2H. Например, если бактериальный белок тестируется на дрожжах, ему может не хватать шаперона для правильной укладки, который присутствует только в его бактериальном хозяине. Более того, белок млекопитающих иногда неправильно модифицируется в дрожжах (например, отсутствует фосфорилирование ), что также может привести к ложным результатам.
  • Y2H находится в ядре. Если тестовые белки не локализованы в ядре (потому что у них есть другие сигналы локализации), два взаимодействующих белка могут оказаться невзаимодействующими.
  • Некоторые белки могут специфически взаимодействовать, когда они совместно экспрессируются в дрожжах, хотя на самом деле они никогда не присутствуют в одной и той же клетке в одно и то же время. Однако в большинстве случаев нельзя исключать, что такие белки действительно экспрессируются в определенных клетках или при определенных обстоятельствах.

Каждый из этих пунктов сам по себе может привести к ложным результатам. Из-за совокупного воздействия всех источников ошибок двугибридные дрожжи следует интерпретировать с осторожностью. Вероятность получения ложноположительных результатов означает, что все взаимодействия должны быть подтверждены анализом с высокой степенью достоверности, например, коиммунопреципитацией эндогенных белков, что затруднительно для крупномасштабных данных белок-белкового взаимодействия. В качестве альтернативы данные Y2H могут быть проверены с использованием нескольких вариантов Y2H или методов биоинформатики. Последний проверяет, экспрессируются ли взаимодействующие белки в одно и то же время, имеют ли некоторые общие черты (такие как аннотации генной онтологии или определенные топологии сети ), имеют ли гомологичные взаимодействия у других видов.

Смотрите также

  • Фаговый дисплей, альтернативный метод обнаружения взаимодействий белок-белок и белок-ДНК
  • Protein array, основанный на чипе метод обнаружения белок-белковых взаимодействий
  • Синтетический генетический анализ, метод на основе дрожжей для изучения взаимодействия генов

использованная литература

внешние ссылки

Последняя правка сделана 2023-03-20 07:05:04
Содержание доступно по лицензии CC BY-SA 3.0 (если не указано иное).
Обратная связь: support@alphapedia.ru
Соглашение
О проекте