Войти
Как векторы работают для передачи генетического материала Генная терапия использует доставку ДНК в клетки, которые могут может выполняться несколькими способами, кратко изложенными ниже. Двумя основными классами методов являются методы, использующие рекомбинантные вирусы (иногда называемые биологическими наночастицами или вирусными векторами), и методы, в которых используется «голая» ДНК или комплексы ДНК (невирусные методы).
Все вирусы связываются со своими хозяевами и вводят свой генетический материал в хозяйскую клетку как часть своего цикла репликации. Этот генетический материал содержит базовые «инструкции» о том, как производить больше копий этих вирусов, взламывая нормальный производственный механизм организма, чтобы удовлетворить потребности вируса. Клетка-хозяин будет выполнять эти инструкции и производить дополнительные копии вируса, что приводит к заражению все большего числа клеток. Некоторые типы вирусов вставляют свой геном в цитоплазму хозяина, но фактически не проникают в клетку. Другие проникают через клеточную мембрану, замаскированные под белковые молекулы, и проникают в клетку.
Существует два основных типа вирусной инфекции: литическая и лизогенная. Вскоре после встраивания ДНК вирусы литического цикла быстро производят больше вирусов, вырываются из клетки и заражают больше клеток. Лизогенные вирусы интегрируют свою ДНК в ДНК клетки-хозяина и могут жить в организме многие годы, прежде чем сработают триггеры. Вирус воспроизводится так же, как и клетка, и не причиняет телесных повреждений, пока не сработает. Триггер высвобождает ДНК из ДНК хозяина и использует ее для создания новых вирусов.
Генетический материал в ретровирусах имеет форму Молекулы РНК, тогда как генетический материал их хозяев находится в форме ДНК. Когда ретровирус заражает клетку-хозяина, он вводит в клетку свою РНК вместе с некоторыми ферментами, а именно обратной транскриптазой и интегразой. Эта молекула РНК из ретровируса должна произвести копию ДНК из своей молекулы РНК, прежде чем она сможет быть интегрирована в генетический материал клетки-хозяина. Процесс создания копии ДНК из молекулы РНК называется обратной транскрипцией. Это осуществляется одним из ферментов вируса, который называется обратной транскриптазой. После того, как эта копия ДНК произведена и находится в свободном состоянии в ядре клетки-хозяина, ее необходимо включить в геном клетки-хозяина. То есть он должен быть вставлен в большие молекулы ДНК в клетке (хромосомы). Этот процесс осуществляется другим ферментом, содержащимся в вирусе, под названием интеграза.
. Теперь, когда генетический материал вируса вставлен, можно сказать, что клетка-хозяин была модифицирована для содержания новых генов. Если эта хозяйская клетка позже разделится, все ее потомки будут содержать новые гены. Иногда гены ретровируса не выражают свою информацию сразу.
Одна из проблем генной терапии с использованием ретровирусов заключается в том, что фермент интегразы может вставлять генетический материал вируса в любую произвольную позицию в геноме вируса. хост; он случайным образом вставляет генетический материал в хромосому. Если генетический материал будет вставлен в середину одного из исходных генов клетки-хозяина, этот ген будет нарушен (инсерционный мутагенез ). Если ген является одним из регулирующих деление клеток, может произойти неконтролируемое деление клеток (т. Е. рак ). Эту проблему недавно начали решать путем использования нуклеаз «цинковые пальцы» или включения определенных последовательностей, таких как контролирующая область локуса бета-глобина, чтобы направить сайт интеграции в определенные хромосомные сайты.
Испытания генной терапии с использованием ретровирусных векторов для лечения Х-сцепленного тяжелого комбинированного иммунодефицита (X-SCID) представляют собой наиболее успешное применение генной терапии на сегодняшний день. Более двадцати пациентов прошли курс лечения во Франции и Великобритании, при этом наблюдается высокий уровень восстановления иммунной системы. Подобные испытания были ограничены или остановлены в США после сообщения о лейкемии у пациентов, получавших лечение в рамках французского исследования генной терапии X-SCID. На сегодняшний день у четырех детей, участвовавших в исследовании во Франции, и у одного ребенка в исследовании в Великобритании, развился лейкоз в результате инсерционного мутагенеза ретровирусным вектором. Все эти дети, кроме одного, хорошо ответили на обычное противолейкозное лечение. Испытания генной терапии для лечения SCID из-за дефицита фермента аденозиндезаминазы (ADA ) (одна из форм SCID) продолжаются с относительным успехом в США, Великобритании, Ирландии, Италии и Японии.
Аденовирусы - это вирусы, которые несут свой генетический материал в виде двухцепочечной ДНК. Они вызывают респираторные, кишечные и глазные инфекции у человека (особенно простуду). Когда эти вирусы заражают хозяйскую клетку, они вводят в хозяина свою молекулу ДНК. Генетический материал аденовирусов не включен (преходящий) в генетический материал клетки-хозяина. Молекула ДНК остается свободной в ядре клетки-хозяина, и инструкции в этой дополнительной молекуле ДНК транскрибируются, как и любой другой ген. Единственное отличие состоит в том, что эти дополнительные гены не реплицируются, когда клетка приближается к клеточному делению, поэтому у потомков этой клетки не будет лишнего гена.
В результате лечение аденовирусом потребует повторного введения в растущей популяции клеток, хотя отсутствие интеграции в геном клетки-хозяина должно предотвратить тип рака, наблюдаемый в исследованиях SCID. Эта векторная система была продвинута для лечения рака, и действительно, первый продукт генной терапии, лицензированный для лечения рака, Gendicine, представляет собой аденовирус. Гендицина, аденовирусная генная терапия на основе р53 была одобрена китайскими регулирующими органами в области пищевых продуктов и лекарств в 2003 году для лечения рака головы и шеи. Адвексин, аналогичный подход к генной терапии от Introgen, был отклонен Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) в 2008 году.
Обеспокоенность по поводу безопасности аденовирусных векторов возникла после 1999 года. смерть Джесси Гелсингера во время участия в исследовании генной терапии. С тех пор работа с использованием аденовирусных векторов была сосредоточена на генетически поврежденных версиях вируса.
Описанные выше вирусные векторы имеют естественные популяции клеток-хозяев, которые они заражают наиболее эффективно. Ретровирусы имеют ограниченный диапазон естественных клеток-хозяев, и хотя аденовирус и аденоассоциированный вирус способны эффективно инфицировать относительно более широкий круг клеток, некоторые типы клеток могут устойчивы к заражению этими вирусами. Присоединение к чувствительной клетке и проникновение в нее опосредуется белковой оболочкой на поверхности вируса. Ретровирусы и аденоассоциированные вирусы имеют один белок, покрывающий их мембрану, в то время как аденовирусы покрыты как белком оболочки, так и волокнами, которые отходят от поверхности вируса. белки оболочки на каждом из этих вирусов связываются с молекулами клеточной поверхности, такими как сульфат гепарина, который также локализует их на поверхности потенциального хозяина. как и в случае специфического белкового рецептора, который либо вызывает структурные изменения вирусного белка, способствующие проникновению, либо локализует вирус в эндосомах, где подкисление просвета вызывает это рефолдинг вирусной оболочки. В любом случае проникновение в потенциальные клетки-хозяева требует благоприятного взаимодействия между белком на поверхности вируса и белком на поверхности клетки.
В целях генной терапии можно либо захотеть ограничивать или расширять диапазон клеток, восприимчивых к трансдукции вектором генной терапии. С этой целью было разработано множество векторов, в которых эндогенные белки оболочки вируса были заменены либо белками оболочки из других вирусов, либо химерными белками. Такая химера может состоять из тех частей вирусного белка, которые необходимы для включения в вирион, а также последовательностей, предназначенных для взаимодействия со специфическими белками клетки-хозяина. Вирусы, в которых белки оболочки были заменены, как описано, называются псевдотипными вирусами. Например, наиболее популярным ретровирусным вектором для использования в исследованиях генной терапии был лентивирус вирус иммунодефицита обезьян, покрытый белками оболочки, G-протеином, из Вирус везикулярного стоматита. Этот вектор называется, и заражает почти универсальный набор клеток. Этот тропизм характерен для G-белка VSV, которым покрыт этот вектор. Было сделано много попыток ограничить тропизм вирусных векторов одной или несколькими популяциями клеток-хозяев. Этот прогресс позволил бы системное введение относительно небольшого количества вектора. Потенциал модификации нецелевых клеток будет ограничен, и многие опасения медицинского сообщества будут сняты. В большинстве попыток ограничить тропизм использовались химерные белки оболочки, несущие фрагменты антител. Эти векторы демонстрируют большие перспективы для развития генной терапии "волшебной пули".
Компетентный к репликации вектор, названный ONYX-015, используется для репликации опухолевых клеток. Было обнаружено, что в отсутствие вирусного белка E1B-55Kd аденовирус вызывает очень быстрый апоптоз инфицированных p53 (+) клеток, что приводит к резкому сокращению потомства вируса и отсутствию последующего распространения. Апоптоз был главным образом результатом способности EIA инактивировать p300. В клетках p53 (-) делеция E1B 55kd не имеет последствий с точки зрения апоптоза, а репликация вируса аналогична репликации вируса дикого типа, что приводит к массовому уничтожению клеток.
Вектор с дефектом репликации удаляет некоторые важные гены. Эти удаленные гены все еще необходимы в организме, поэтому их заменяют либо вспомогательным вирусом, либо молекулой ДНК.
Векторы с дефектом репликации всегда содержат «перенос» построить ». Конструкция для переноса несет ген, который должен быть трансдуцирован, или «трансген». Конструкция для переноса также несет последовательности, которые необходимы для общего функционирования вирусного генома: последовательность упаковки, повторы для репликации и, при необходимости, примирование обратной транскрипции. Это названные цис-действующие элементы, потому что они должны находиться на том же участке ДНК, что и вирусный геном и интересующий ген. Транс-действующие элементы - это вирусные элементы, которые могут быть закодированы на другой молекуле ДНК. Например, структурные белки вируса могут быть экспрессированы из другого генетического элемента, чем вирусный геном.
Вирус простого герпеса - нейротропный вирус человека.. Это в основном исследуется на перенос генов в нервной системе. Вирус HSV-1 дикого типа способен инфицировать нейроны и уклоняться от иммунного ответа хозяина, но все же может реактивироваться и производить литический цикл репликации вируса. Поэтому обычно используют мутантные штаммы HSV-1, которые не обладают способностью к репликации. Хотя латентный вирус не является очевидным с точки зрения транскрипции, он обладает специфическими для нейронами промоторами, которые могут продолжать нормально функционировать. Антитела к ВПГ-1 распространены у людей, однако осложнения, вызванные герпетической инфекцией, довольно редки. Следует проявлять осторожность в редких случаях энцефалита, и это дает некоторое обоснование для использования HSV-2 в качестве вирусного вектора, поскольку он обычно имеет тропизм для нейронных клеток, иннервирующих урогенитальную область тела, и может затем избавить хозяина от тяжелой патологии в головном мозге..
Невирусные методы обладают определенными преимуществами перед вирусными методами, при этом простое крупномасштабное производство и низкая иммуногенность хозяина составляют всего два. Ранее низкие уровни трансфекции и экспрессии гена ставили невирусные методы в невыгодное положение; однако недавние достижения в векторной технологии позволили получить молекулы и методы с эффективностью трансфекции, аналогичной эффективности вирусов.
Это простейший метод невирусной трансфекции. Клинические испытания внутримышечной инъекции плазмиды голой ДНК прошли с некоторым успехом; однако экспрессия была очень низкой по сравнению с другими методами трансфекции. В дополнение к испытаниям с плазмидами, были испытания с продуктом «голый» ПЦР, которые имели аналогичный или больший успех. Поглощение обнаженной ДНК клетками обычно неэффективно. Исследовательские усилия, направленные на повышение эффективности поглощения голой ДНК, дали несколько новых методов, таких как электропорация, сонопорация и использование «генной пушки », который направляет покрытые ДНК частицы золота в клетку с использованием газа под высоким давлением.
Электропорация - это метод, в котором используются короткие импульсы высокого напряжения переносить ДНК через клеточную мембрану. Считается, что этот шок вызывает временное образование пор в клеточной мембране, позволяя молекулам ДНК проходить сквозь них. Электропорация обычно эффективна и работает с широким спектром типов клеток. Однако высокая скорость гибели клеток после электропорации ограничивает его использование, в том числе в клинических условиях.
Совсем недавно в экспериментах по генной терапии использовали более новый метод электропорации, называемый электронно-лавинной трансфекцией. Используя высоковольтный плазменный разряд, ДНК эффективно доставлялась после очень коротких (микросекундных) импульсов. По сравнению с электропорацией этот метод привел к значительному повышению эффективности и меньшему повреждению клеток.
Использование бомбардировки частицами, или генная пушка, является другим физическим методом трансфекции ДНК. В этой технике, ДНК наносят на частицы золота и загружают в устройство, которое генерирует силу для достижения проникновения ДНК в клетки, в результате чего золота позади на «остановку» диск.
Сонопорация использует ультразвуковые частоты для доставки ДНК в клетки. Считается, что процесс акустической кавитации разрушает клеточную мембрану и позволяет ДНК перемещаться в клетки.
В методе, называемом магнитофекцией, ДНК образует комплекс с магнитными частицами, и магнит помещается под чашку для культивирования тканей, чтобы привести комплексы ДНК в контакт с клеточный монослой.
включает быстрое введение большого объема раствора в сосудистую сеть (например, в нижнюю полую вену, желчный проток, или хвостовая вена ). Раствор содержит молекулы, которые должны быть вставлены в клетки, такие как ДНК-плазмиды или миРНК, и переносу этих молекул в клетки способствует повышенное гидростатическое давление, вызванное большим объемом введенного раствора.
Использование синтетических олигонуклеотидов в генной терапии заключается в дезактивации генов, участвующих в процессе заболевания. Есть несколько способов, которыми это достигается. Одна стратегия использует антисмысловой, специфичный для целевого гена, чтобы нарушить транскрипцию дефектного гена. Другой использует небольшие молекулы РНК, называемые миРНК, чтобы сигнализировать клетке о расщеплении специфических уникальных последовательностей в транскрипте мРНК дефектного гена, нарушая трансляцию дефектной мРНК и, следовательно, экспрессию ген. Еще одна стратегия использует двухцепочечные олигодезоксинуклеотиды в качестве приманки для факторов транскрипции, которые необходимы для активации транскрипции целевого гена. Факторы транскрипции связываются с ловушками вместо промотора дефектного гена, что снижает транскрипцию целевого гена, снижая экспрессию. Кроме того, олигонуклеотиды одноцепочечной ДНК использовались для управления изменением одного основания в мутантном гене. Олигонуклеотид предназначен для отжига с комплементарностью к целевому гену, за исключением центрального основания, целевого основания, которое служит основой-матрицей для репарации. Этот метод называется репарацией гена, опосредованной олигонуклеотидами, направленной репарацией гена или направленным изменением нуклеотидов.
Для улучшения доставки новой ДНК в клетку ДНК должна быть защищена от повреждений и иметь положительный заряд. Первоначально для построения липоплексов синтетических векторов использовали анионные и нейтральные липиды. Однако, несмотря на то, что с ними связана небольшая токсичность, что они совместимы с биологическими жидкостями и что существует возможность их адаптации к тканеспецифичности; их производство сложно и требует много времени, поэтому внимание было обращено на катионные версии.
Катионные липиды из-за их положительного заряда были впервые использованы для конденсации отрицательно заряженных молекул ДНК, чтобы облегчить инкапсуляцию ДНК в липосомы. Позже было обнаружено, что использование катионных липидов значительно увеличивает стабильность липоплексов. Также в результате своего заряда катионные липосомы взаимодействуют с клеточной мембраной, эндоцитоз широко считается основным путем, по которому клетки поглощают липоплексы. Эндосомы образуются в результате эндоцитоза, однако, если гены не могут быть выпущены в цитоплазму путем разрушения мембраны эндосомы, они будут отправлены в лизосомы, где вся ДНК будет разрушена, прежде чем они смогут выполнить свои функции. Было также обнаружено, что, хотя сами катионные липиды могут конденсировать и инкапсулировать ДНК в липосомы, эффективность трансфекции очень низкая из-за отсутствия способности с точки зрения «эндосомального выхода». Однако при добавлении вспомогательных липидов (обычно электронейтральных липидов, таких как ДОФЭ) для образования липоплексов наблюдалась гораздо более высокая эффективность трансфекции. Позже было выяснено, что определенные липиды обладают способностью дестабилизировать эндосомные мембраны, чтобы облегчить выход ДНК из эндосомы, поэтому эти липиды называются фузогенными липидами. Хотя катионные липосомы широко использовались в качестве альтернативы векторам доставки генов, наблюдалась также дозозависимая токсичность катионных липидов, которая могла ограничивать их терапевтическое применение.
Чаще всего липоплексы используются для переноса генов в раковые клетки, где поставляемые гены активируют гены контроля супрессоров опухолей в клетке и снижают активность онкогенов. Недавние исследования показали, что липоплексы полезны для трансфекции респираторных эпителиальных клеток.
Полимерсомы представляют собой синтетические версии липосом (везикул с липидный бислой ), состоящий из амфифильных блок-сополимеров. Они могут инкапсулировать либо гидрофильное, либо гидрофобное содержимое и могут использоваться для доставки в клетки груза, такого как ДНК, белки или лекарства. Преимущества полимерсом перед липосомами включают большую стабильность, механическую прочность, время циркуляции крови и емкость хранения.
Комплексы полимеров с ДНК называются полиплексами. Большинство полиплексов состоит из катионных полимеров, и их создание основано на самосборке за счет ионных взаимодействий. Одно важное различие между методами действия полиплексов и липоплексов состоит в том, что полиплексы не могут напрямую высвобождать свою ДНК-нагрузку в цитоплазму. В результате требовалась котрансфекция эндосомолитическими агентами, такими как инактивированный аденовирус, для облегчения выхода наночастиц из эндоцитарной везикулы, образовавшейся во время захвата частиц. Однако лучшее понимание механизмов, с помощью которых ДНК может ускользать от эндолизосомного пути, то есть эффекта протонной губки, привело к появлению новых стратегий синтеза полимеров, таких как включение протонных остатков в основную цепь полимера, и оживило исследования систем на основе поликатионов.
Благодаря своей низкой токсичности, высокой нагрузочной способности и простоте изготовления поликатионные наноносители демонстрируют большие перспективы по сравнению с их конкурентами, такими как вирусные векторы, которые демонстрируют высокую иммуногенность и потенциальную канцерогенность, и векторы на основе липидов, которые вызывают токсичность в зависимости от дозы. Полиэтиленимин и хитозан являются одними из полимерных носителей, которые широко исследовались для разработки терапевтических средств для доставки генов. Другие поликатионные носители, такие как поли (бета-аминоэфиры) и полифосфорамидат, добавляются в библиотеку потенциальных носителей генов. В дополнение к разнообразию полимеров и сополимеров, легкость управления размером, формой, химией поверхности этих полимерных наноносителей дает им преимущество в способности нацеливания и использования преимуществ повышенной проницаемости и удерживающего эффекта.
A дендример представляет собой сильно разветвленную макромолекулу сферической формы. Поверхность частицы может быть функционализирована многими способами, и многие свойства полученной конструкции определяются ее поверхностью.
В частности, можно сконструировать катионный дендример, то есть дендример с положительным поверхностным зарядом. В присутствии генетического материала, такого как ДНК или РНК, зарядовая комплементарность приводит к временной ассоциации нуклеиновой кислоты с катионным дендримером. Достигнув места назначения, комплекс дендример-нуклеиновая кислота затем попадает в клетку посредством эндоцитоза.
В последние годы эталоном для агентов трансфекции являются катионные липиды. Сообщалось, что к ограничениям этих конкурирующих реагентов относятся: отсутствие способности трансфицировать некоторые типы клеток, отсутствие надежных возможностей активного нацеливания, несовместимость с моделями на животных и токсичность. Дендримеры предлагают прочную ковалентную конструкцию и полный контроль над структурой молекулы и, следовательно, размером. Вместе это дает убедительные преимущества по сравнению с существующими подходами.
Производство дендримеров исторически было медленным и дорогостоящим процессом, состоящим из множества медленных реакций, что серьезно ограничивало их коммерческое развитие. Компания Dendritic Nanotechnologies из Мичигана открыла метод производства дендримеров с использованием кинетической химии, процесса, который не только снизил стоимость в три раза, но и сократил время реакции с месяца до нескольких дней. Эти новые дендримеры "Priostar" могут быть специально сконструированы так, чтобы нести полезную нагрузку ДНК или РНК, которая трансфицирует клетки с высокой эффективностью с небольшой токсичностью или без нее.
Неорганические наночастицы, такие как золото, диоксид кремния, оксид железа (например, магнитофекция ) и фосфаты кальция, как было показано, способны доставлять гены. Некоторые из преимуществ неорганических векторов заключаются в их стабильности при хранении, низкой стоимости производства, а зачастую и времени, низкой иммуногенности и устойчивости к микробной атаке. Было показано, что наноразмерные материалы размером менее 100 нм эффективно улавливают ДНК или РНК и позволяют ей ускользать из эндосомы без деградации. Также было показано, что неорганические вещества демонстрируют улучшенную трансфекцию in vitro для прикрепленных клеточных линий благодаря их повышенной плотности и предпочтительному расположению на основании чашки для культивирования. Квантовые точки также успешно использовались и позволяют сочетать генную терапию со стабильным маркером флуоресценции. Разработанные органические наночастицы также находятся в стадии разработки, которые могут быть использованы для совместной доставки генов и терапевтических агентов.
Проникающие в клетки пептиды (CPP), также известные как пептиды домены трансдукции (PTD) - это короткие пептиды (< 40 amino acids) that efficiently pass through cell membranes while being covalently or non-covalently bound to various molecules, thus facilitating these molecules’ entry into cells. Cell entry occurs primarily by эндоцитоз, но существуют и другие механизмы проникновения. Примеры молекул-груза СРР включают нуклеиновые кислоты, липосомы и лекарства с низкой молекулярной массой.
Груз СРР может быть направлен в конкретные клеточные органеллы путем включения последовательности локализации в последовательности CPP. Например, последовательности ядерной локализации обычно используются для направления груза CPP в ядро. Для наведения в митохондрии можно использовать направленную на митохондрии последовательность ; этот метод используется в протофекции (метод, позволяющий встраивать чужеродную митохондриальную ДНК в митохондрии клеток).
Из-за того, что каждый метод переноса гена имеет недостатки, было разработано несколько гибридных методов, которые объединяют два или более методов. Виросомы являются одним из примеров; они объединяют липосомы с инактивированным ВИЧ или вирусом гриппа. Было показано, что это обеспечивает более эффективный перенос генов в респираторных эпителиальных клетках, чем только вирусные или липосомные методы. Другие методы включают смешивание других вирусных векторов с или.
