Войти
V (D) J-рекомбинация - это механизм соматической рекомбинации, который происходит только в развитие лимфоцитов на ранних стадиях созревания Т- и В-клеток. Это приводит к очень разнообразному репертуару антител / иммуноглобулинов и рецепторов Т-клеток (TCR), обнаруженных в В-клетках и Т-клетках, соответственно. Этот процесс является определяющим признаком адаптивной иммунной системы..
Рекомбинация V (D) J у млекопитающих происходит в первичных лимфоидных органах (костный мозг для В-клеток и тимус для Т-клеток) и почти случайным образом перестраивает переменные (V), соединяющиеся (J) и, в некоторых случаях, сегменты гена разнообразия (D). В конечном итоге этот процесс приводит к новым аминокислотным последовательностям в антигенсвязывающих областях иммуноглобулинов и TCR, которые позволяют распознавать антигены почти всех патогенов, включая бактерии, вирусы, паразиты и черви, а также «измененные собственные клетки», как показано в раке. Распознавание также может иметь аллергическую природу (например, на пыльцу или другие аллергены ) или может соответствовать тканям хозяина и приводить к аутоиммунитету.
в 1987 г. Сусуму Тонегава был удостоен Нобелевской премии по физиологии и медицине «за открытие генетического принципа генерации разнообразия антител».
Молекулы человеческого антитела (включая рецепторы В-клеток ) состоит из тяжелых и легких цепей, каждая из которых содержит как константные (C), так и вариабельные (V) области, генетически кодируемые в трех локусах :
Каждая тяжелая цепь или легкая цепь ген содержит несколько копий трех разных t типов генных сегментов для вариабельных областей белков антител. Например, область тяжелой цепи иммуноглобулина человека содержит 2 генных сегмента констант (Cμ и Cδ) и 44 вариабельных (V) генных сегмента, плюс 27 генных сегментов разнообразия (D) и 6 генных сегментов соединения (J). Гены легкой цепи имеют либо один (Cκ), либо четыре (Cλ) постоянных генных сегмента с многочисленными генными сегментами V и J, но не имеют генных сегментов D. Перестройка ДНК заставляет одну копию каждого типа сегмента гена попасть в любой данный лимфоцит, создавая огромный репертуар антител; возможны примерно 3 × 10 комбинаций, хотя некоторые из них удаляются из-за самореактивности.
Большинство Т-клеточных рецепторов состоит из переменной альфа-цепи и бета-цепи. Гены рецепторов Т-клеток подобны генам иммуноглобулинов тем, что они также содержат несколько сегментов генов V, D и J в своих бета-цепях (и сегменты генов V и J в их альфа-цепях), которые перестраиваются во время развития лимфоцита в снабдить эту клетку уникальным рецептором антигена . Рецептор Т-клетки в этом смысле является топологическим эквивалентом антигенсвязывающего фрагмента антитела, оба являются частью суперсемейства иммуноглобулинов.
Аутоиммунный ответ предотвращается путем устранения клеток, которые реагируют на себя. Это происходит в тимусе путем тестирования клетки на набор аутоантигенов, экспрессируемых с помощью функции аутоиммунного регулятора (AIRE). Локус легкой цепи лямбда иммуноглобулина содержит гены, кодирующие белок, которые могут быть потеряны при его перестройке. Это основано на физиологическом механизме и не является патогенетическим для лейкозов или лимфом. Клетка сохраняется, если она создает успешный продукт, который не реагирует самостоятельно, в противном случае она сокращается посредством апоптоза.
Упрощенный обзор V (D) J-рекомбинации тяжелых цепей иммуноглобулина В развивающейся В-клетке первое событие рекомбинации происходит между одним D и одним J-сегментами гена локуса тяжелой цепи. Любая ДНК между этими двумя сегментами гена удаляется. За этой D-J-рекомбинацией следует присоединение одного генного сегмента V из области, расположенной выше вновь образованного комплекса DJ, с образованием реаранжированного генного сегмента VDJ. Все остальные генные сегменты между сегментами V и D теперь удалены из генома клетки. Генерируется первичный транскрипт (несплицированная РНК), содержащий VDJ-область тяжелой цепи и константные мю- и дельта-цепи (C μ и C δ). (т. е. первичный транскрипт содержит сегменты: V-D-J-C μ-Cδ). Первичная РНК обрабатывается для добавления полиаденилированного (поли-A) хвоста после цепи C μ и для удаления последовательности между сегментом VDJ и этим постоянным генным сегментом. Трансляция этой мРНК приводит к продукции белка тяжелой цепи IgM.
Каппа (κ) и лямбда (λ) цепи локусов легкой цепи иммуноглобулина перегруппировываются очень сходным образом, за исключением того, что в легких цепях отсутствует сегмент D. Другими словами, первая стадия рекомбинации легких цепей включает соединение цепей V и J с образованием комплекса VJ перед добавлением гена константной цепи во время первичной транскрипции. Трансляция сплайсированной мРНК для каппа- или лямбда-цепей приводит к образованию белка легкой цепи Ig κ или Ig λ.
Сборка тяжелой цепи Ig μ и одной из легких цепей приводит к образованию мембраносвязанной формы иммуноглобулина IgM, которая экспрессируется на поверхности незрелой В-клетки.
Во время развития тимоцитов цепи Т-клеточных рецепторов (TCR) претерпевают по существу такую же последовательность событий упорядоченной рекомбинации, что и описан для иммуноглобулинов. Рекомбинация D-to-J происходит сначала в β-цепи TCR. Этот процесс может включать либо присоединение сегмента гена D β 1 к одному из шести сегментов J β 1, либо соединение сегмента гена D β 2. к одному из шести сегментов J β 2. За рекомбинацией DJ следует (как указано выше) перегруппировки V β -в D βJβ. Все генные сегменты между сегментами гена V β-Dβ-Jβво вновь образованном комплексе удаляются, и синтезируется первичный транскрипт, который включает ген константного домена (V β-Dβ-Jβ-Cβ). Транскрипция мРНК сплайсирует любую промежуточную последовательность и позволяет транслировать полноразмерный белок для β-цепи TCR.
Перестройка альфа (α) цепи TCR следует за перестройкой β-цепи и напоминает перегруппировку V-J, описанную для легких цепей Ig (см. Выше). Сборка β- и α-цепей приводит к образованию αβ-TCR, который экспрессируется на большинстве Т-клеток.
Процесс рекомбинации V (D) J опосредуется рекомбиназой VDJ, которая представляет собой разнообразный набор ферментов. Ключевыми ферментами являются гены, активирующие рекомбинацию 1 и 2 (RAG), терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT) и нуклеаза Artemis, член повсеместного негомологичного конца присоединение к пути (NHEJ) для репарации ДНК. Известно, что в этот процесс вовлечены несколько других ферментов, в том числе ДНК-зависимая протеинкиназа (ДНК-PK), перекрестно комплементарный белок 4 репарации рентгеновских лучей (XRCC4), ДНК-лигаза IV, негомологичный фактор присоединения концов 1 (NHEJ1; также известный как Cernunnos или XRCC4-подобный фактор [XLF]), недавно обнаруженный паралог XRCC4 и XLF (PAXX) и ДНК-полимеразы λ и μ. Некоторые участвующие ферменты специфичны для лимфоцитов (например, RAG, TdT), тогда как другие обнаруживаются в других типах клеток и даже повсеместно (например, компоненты NHEJ).
Чтобы поддерживать специфичность рекомбинации, рекомбиназа V (D) J распознает и связывается с сигнальными последовательностями рекомбинации (RSS), фланкирующими переменную (V), разнообразие (D) и присоединяющиеся ( J) сегменты генов. RSS состоят из трех элементов: гептамера из семи консервативных нуклеотидов, спейсерной области длиной 12 или 23 пар оснований и нонамера из девяти консервативных нуклеотидов. Хотя большинство RSS различаются по последовательности, консенсусные гептамерные и неамерные последовательности представляют собой CACAGTG и ACAAAAACC, соответственно; и хотя последовательность спейсерной области плохо консервативна, длина высококонсервативна. Длина спейсерной области соответствует приблизительно одному (12 пар оснований) или двум виткам (23 пары оснований) спирали ДНК. Следуя так называемому правилу 12/23, сегменты гена, которые должны быть рекомбинированы, обычно примыкают к RSS разной длины спейсера (то есть один имеет «12RSS», а другой - «23RSS»). Это важная особенность в регуляции рекомбинации V (D) J.
Рекомбинация V (D) J начинается, когда рекомбиназа V (D) J (через активность RAG1) связывает RSS, фланкирующий сегмент кодирующего гена (V, D или J), и создает одноцепочечный разрыв в ДНК между первым основанием RSS (непосредственно перед гептамером) и кодирующим сегментом. Он по существу энергетически нейтрален (нет необходимости в гидролизе АТФ ) и приводит к образованию свободной 3 'гидроксильной группы и 5' фосфатной группы на та же прядь. Реактивная гидроксильная группа позиционируется рекомбиназой для атаки фосфодиэфирной связи противоположной цепи, образуя два конца ДНК: шпильку (стебель-петля) на кодирующем сегменте и тупой конец на сигнальном сегменте. Современная модель заключается в том, что надрезание ДНК и образование шпильки происходит на обеих цепях одновременно (или почти так) в комплексе, известном как центр рекомбинации.
Тупые сигнальные концы лигируются вместе, образуя круговой кусок ДНК содержащие все промежуточные последовательности между кодирующими сегментами, известные как сигнальное соединение (хотя по своей природе кольцевые, это не следует путать с плазмидой ). Хотя первоначально считалось, что они теряются во время последовательных делений клеток, есть доказательства того, что сигнальные суставы могут повторно войти в геном и привести к патологиям, активируя онкогены или прерывая функцию гена-супрессора опухоли (s) [Ссылка].
Концы кодирования дополнительно обрабатываются до их лигирования несколькими событиями, которые в конечном итоге приводят к разнообразию соединений. Процессинг начинается, когда DNA-PK связывается с каждым разорванным концом ДНК и привлекает несколько других белков, включая Artemis, XRCC4, ДНК-лигазу IV, Cernunnos и несколько ДНК-полимераз. ДНК-ПК образует комплекс, который приводит к его аутофосфорилированию, что приводит к активации Artemis. Шпильки кодирующего конца открываются в результате активности Артемиды. Если их открыть в центре, получится тупой конец ДНК; однако во многих случаях отверстие находится «не по центру» и приводит к тому, что на одной нити остаются лишние основания (выступ). Они известны как палиндромные (P) нуклеотиды из-за палиндромной природы последовательности, образующейся, когда ферменты репарации ДНК устраняют выступ. Процесс раскрытия шпильки Artemis является важным этапом рекомбинации V (D) J и является дефектом в модели мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (scid).
Далее, XRCC4, Cernunnos и ДНК-PK выравнивают ДНК. заканчивается и привлекает терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT), матрицу-независимую ДНК-полимеразу, которая добавляет нетематические (N) нуклеотиды к кодирующему концу. Добавление в основном случайное, но TdT действительно отдает предпочтение нуклеотидам G / C. Как и все известные ДНК-полимеразы, TdT добавляет нуклеотиды к одной цепи в направлении от 5 'к 3'.
Наконец, экзонуклеазы могут удалять основания с кодирующих концов (включая любые нуклеотиды P или N, которые могли образоваться). ДНК-полимеразы λ и μ затем вставляют дополнительные нуклеотиды по мере необходимости, чтобы сделать два конца совместимыми для соединения. Это стохастический процесс, поэтому может произойти любая комбинация добавления нуклеотидов P и N и экзонуклеолитического удаления (или не может быть вообще никакого). Наконец, обработанные кодирующие концы лигируют вместе ДНК-лигазой IV.
Все эти события процессинга приводят к образованию антигенсвязывающей области, которая сильно варьируется, даже когда рекомбинируются одни и те же генные сегменты. Рекомбинация V (D) J позволяет генерировать иммуноглобулины и Т-клеточные рецепторы к антигенам, с которыми ни организм, ни его предок (предки) не должны были ранее сталкиваться, что обеспечивает адаптивный иммунный ответ на новые патогены, которые развиваются, или на те, которые часто изменение (например, сезонный грипп ). Однако главное предостережение в отношении этого процесса состоит в том, что последовательность ДНК должна оставаться в рамке, чтобы поддерживать правильную аминокислотную последовательность в конечном белковом продукте. Если результирующая последовательность выходит за рамки кадра, развитие клетки будет остановлено, и клетка не доживет до зрелости. Таким образом, рекомбинация V (D) J является очень дорогостоящим процессом, который должен строго регулироваться и контролироваться.
