Микроскопия с двухфотонным возбуждением

редактировать
Не следует путать с микроскопией изображений второй гармоники. Микроскопия двухфотонного возбуждения кишечника мыши. Красный: актин. Зеленый: ядра клеток. Синий: слизь бокаловидных клеток. Получено на длине волны 780 нм с использованием титан-сапфирового лазера.

Микроскопия с двухфотонным возбуждением ( TPEF или 2PEF) - это метод флуоресцентной визуализации, который позволяет получать изображения живой ткани толщиной до одного миллиметра. В отличие от традиционной флуоресцентной микроскопии, в которой длина волны возбуждения короче длины волны излучения, двухфотонное возбуждение требует одновременного возбуждения двумя фотонами с большей длиной волны, чем излучаемый свет. В микроскопии с двухфотонным возбуждением обычно используется возбуждающий свет в ближней инфракрасной области (NIR), который также может возбуждать флуоресцентные красители. Однако при каждом возбуждении поглощаются два фотона БИК-света. Использование инфракрасного света сводит к минимуму рассеяние в тканях. Из-за многофотонного поглощения фоновый сигнал сильно подавляется. Оба эффекта приводят к увеличению глубины проникновения для этой техники. Двухфотонное возбуждение может быть превосходной альтернативой конфокальной микроскопии благодаря более глубокому проникновению в ткани, эффективному обнаружению света и уменьшенному фотообесцвечиванию.

Двухфотонное флуоресцентное изображение (зеленое) поперечного сечения корневища, окрашенного ландышом. Волнение происходит на 840 нм, а красный и синий цвета представляют другие каналы многофотонной техники, которые были наложены друг на друга.

СОДЕРЖАНИЕ

  • 1 Концепция
  • 2 Развитие
  • 3 Приложения
    • 3.1 Основные
    • 3.2 Исследования рака
    • 3.3 Неврология
      • 3.3.1 Визуализация мозга in vivo
  • 4 Возбуждение высшего порядка
  • 5 Красители и флуоресцентные белки для микроскопии с двухфотонным возбуждением
  • 6 См. Также
  • 7 Источники
  • 8 ссылки
  • 9 Внешние ссылки

Концепция

Схематическое изображение уровней энергии (диаграммы Яблонского) процесса флуоресценции, пример флуоресцентного красителя, излучающего свет с длиной волны 460 нм. Один (фиолетовый, 1PEF), два (светло-красный, 2PEF) или три (темно-красный, 3PEF) фотона поглощаются, чтобы испустить фотон флуоресценции (бирюзовый). Оптический отклик от точечного источника. Слева направо: рассчитанные распределения интенсивности xy (вверху) и rz (внизу) с логарифмической шкалой для точечного источника, полученного с помощью широкого поля (a), 2PEF (b) и конфокальной микроскопии (c). 2PEF и конфокальные формы имеют лучшее отношение сигнал / шум, чем широкое поле. Распределение 2PEF больше из-за того, что за распределение интенсивности отвечает длина волны в два раза больше, чем в случае широкого или конфокального поля. Эти распределения интенсивности также известны как функции рассеяния точки. Оптические условия: длины волн возбуждения 488 нм и 900 нм соответственно для 1PEF и 2PEF; длина волны излучения 520 нм; числовая апертура составляет 1,3 с целью погружения масла.

В двухфотонном возбуждении используется двухфотонное поглощение - концепция, впервые описанная Марией Гепперт Майер (1906–1972) в ее докторской диссертации в 1931 году и впервые обнаруженная в 1961 году в кристалле CaF 2: Eu 2+ с использованием лазерного возбуждения Вольфгангом Кайзером.. В 1962 году Исаак Абелла показал на парах цезия возможность двухфотонного возбуждения отдельных атомов.

Флуоресцентная микроскопия с двухфотонным возбуждением имеет сходство с другими методами конфокальной лазерной микроскопии, такими как лазерная сканирующая конфокальная микроскопия и рамановская микроскопия. Эти методы используют сфокусированные лазерные лучи, сканированные в растровом шаблоне, для создания изображений, и оба имеют эффект оптического сечения. В отличие от конфокальных микроскопов, многофотонные микроскопы не имеют отверстий-точечных отверстий, которые придают конфокальным микроскопам качество оптического сечения. Оптическое сечение, получаемое с помощью многофотонных микроскопов, является результатом функции рассеяния точки возбуждения: функция рассеяния точки многофотонного излучения обычно имеет форму гантели (более длинную в плоскости xy) по сравнению с функцией рассеяния точки в форме вертикального шара для регби конфокальной микроскопы. Концепция двухфотонного возбуждения основана на идее, что два фотона со сравнительно меньшей энергией фотона, чем требуется для возбуждения одного фотона, также могут возбудить флуорофор в одном квантовом событии. Каждый фотон несет примерно половину энергии, необходимой для возбуждения молекулы. Возбуждение приводит к последующему испусканию фотона флуоресценции с тем же квантовым выходом, который был бы результатом обычного однофотонного поглощения. Испускаемый фотон обычно имеет более высокую энергию (более короткую длину волны), чем любой из двух возбуждающих фотонов. Вероятность почти одновременного поглощения двух фотонов чрезвычайно мала. Поэтому обычно требуется высокий пиковый поток возбуждающих фотонов, обычно генерируемый фемтосекундным импульсным лазером. Целью использования двухфотонного эффекта является то, что осевой разброс функции рассеяния точки существенно меньше, чем при однофотонном возбуждении. В результате увеличивается размер по оси z, что позволяет вырезать тонкие оптические секции. Кроме того, во многих интересных случаях форма пятна и его размер могут быть изменены для достижения конкретных желаемых целей. Лазеры возбуждения с более длинной длиной волны и меньшей энергией (обычно инфракрасные) в многофотонных микроскопах хорошо подходят для визуализации живых клеток, поскольку они наносят меньший ущерб, чем коротковолновые лазеры, обычно используемые для однофотонного возбуждения, поэтому клетки можно наблюдать на предмет обнаружения живых клеток. более длительные периоды с меньшим количеством токсических эффектов.

Наиболее часто используемые флуорофоры имеют спектры возбуждения в диапазоне 400–500 нм, тогда как лазер, используемый для возбуждения двухфотонной флуоресценции, находится в диапазоне ~ 700–1000 нм (инфракрасный), создаваемый лазерами на Ti-сапфирове. Если флуорофор поглощает два инфракрасных фотона одновременно, он будет поглощать достаточно энергии, чтобы перейти в возбужденное состояние. Затем флуорофор будет излучать одиночный фотон с длиной волны, которая зависит от типа используемого флуорофора (обычно в видимом спектре). Поскольку два фотона поглощаются во время возбуждения флуорофора, вероятность флуоресцентного излучения флуорофоров увеличивается квадратично с интенсивностью возбуждения. Следовательно, гораздо больше двухфотонной флуоресценции генерируется там, где лазерный луч сильно сфокусирован, чем там, где он более рассеян. Фактически возбуждение ограничивается крошечным фокусным объемом (~ 1 фемтолитр), что приводит к высокой степени отклонения объектов, находящихся вне фокуса. Такая локализация возбуждения является ключевым преимуществом по сравнению с микроскопами с однофотонным возбуждением, в которых необходимо использовать такие элементы, как микроотверстия, для подавления расфокусированной флуоресценции. Затем флуоресценция образца улавливается высокочувствительным детектором, например фотоумножителем. Эта наблюдаемая интенсивность света становится одним пикселем в конечном изображении; фокусная точка сканируется по всей желаемой области образца, чтобы сформировать все пиксели изображения.

Разработка

Схема двухфотонного микроскопа.

Двухфотонная микроскопия была впервые и запатентовала по Винфриду Денку и Джеймс Стриклер в лаборатории Уатт У. Уэбба в Корнельском университете в 1990 году они объединили идею ДФПА с использованием лазерного сканера. В микроскопии с двухфотонным возбуждением инфракрасный лазерный луч фокусируется через линзу объектива. Ti-сапфировый лазер обычно используется имеет ширину импульса приблизительно 100 фемтосекунд (Fs) и частота повторения около 80 МГц, что позволяет с высокой плотностью фотонов и потоком, требующийся для поглощения двух фотонов и является перестраиваемым в широком диапазоне длин волн. Волоконные лазеры с синхронизацией мод, легированные Yb, с импульсами 325 фс также использовались для визуализации коллагена, демонстрируя глубину проникновения более 320 мкм в коллаген, что значительно превосходит глубины от 250 до 300 мкм, достижимые при подключении к обычному Ti- сапфировый лазер с возбуждением.

Дополнительные преимущества дает использование инфракрасного света для возбуждения флуорофоров в светорассеивающей ткани. Более длинные волны рассеиваются в меньшей степени, чем более короткие, что является преимуществом для получения изображений с высоким разрешением. Кроме того, эти фотоны с меньшей энергией с меньшей вероятностью вызовут повреждение за пределами фокального объема. По сравнению с конфокальным микроскопом обнаружение фотонов намного более эффективно, поскольку даже рассеянные фотоны вносят вклад в полезный сигнал. Эти преимущества для получения изображений в рассеивающих тканях были признаны только через несколько лет после изобретения микроскопии с двухфотонным возбуждением.

Есть несколько предостережений при использовании двухфотонной микроскопии: импульсные лазеры, необходимые для двухфотонного возбуждения, намного дороже, чем лазеры непрерывного действия (CW), используемые в конфокальной микроскопии. Спектр двухфотонного поглощения молекулы может значительно отличаться от его однофотонного аналога. Для очень тонких объектов, таких как изолированные клетки, однофотонные (конфокальные) микроскопы могут создавать изображения с более высоким оптическим разрешением из-за более коротких длин волн возбуждения. С другой стороны, в случае рассеивающей ткани превосходные возможности двухфотонного микроскопа для оптического сечения и обнаружения света приводят к лучшим характеристикам.

Приложения

Главный

Двухфотонная микроскопия используется во многих областях, включая физиологию, нейробиологию, эмбриологию и тканевую инженерию. Благодаря этой технике даже тонкие, почти прозрачные ткани (например, клетки кожи) визуализируются с четкими деталями. Возможности высокоскоростной визуализации двухфотонной микроскопии также могут быть использованы в неинвазивной оптической биопсии. В клеточной биологии двухфотонная микроскопия удачно использовалась для получения локализованных химических реакций. Используя двухфотонную флуоресценцию и микроскопию на основе генерации второй гармоники, было показано, что молекулы типа органических порфиринов могут иметь разные дипольные моменты перехода для двухфотонной флуоресценции и генерации второй гармоники, которые, как полагают, происходят от одного и того же диполя перехода. момент. Было показано, что невырожденное двухфотонное возбуждение или использование двух фотонов с разными длинами волн увеличивает флуоресценцию всех протестированных малых молекул и флуоресцентных белков.

Исследования рака

2PEF также оказался очень ценным для характеристики рака кожи. Также было показано, что он выявляет остановку опухолевых клеток, взаимодействие опухолевых клеток с тромбоцитами, взаимодействие опухолевых клеток и лейкоцитов и процессы метастатической колонизации.

Нейронауки

2PEF и 3PEF используются для характеристики интактных нервных тканей.

Визуализация мозга in vivo

Многофотонная флуоресценция (2PEF и 3PEF) - полезный способ визуализации мозга in vivo.

Изображения капилляров и эритроцитов у мышей публикуются с помощью (выбритого) черепа, что свидетельствует о большей глубине и высоком разрешении на более отдаленных расстояниях, чем при микроскопии. Об этом говорится в статье «Двухфотонная визуализация in vivo выявляет острый спазм сосудов головного мозга и микротромбоз после легкой травмы головного мозга у мышей».

Возбуждение высшего порядка

Также возможно одновременное поглощение трех или более фотонов, что позволяет использовать микроскопию с более мощным многофотонным возбуждением. Так называемая «трехфотонная флуоресцентная микроскопия» (3PEF) является наиболее часто используемым методом после 2PEF, которому он дополняет.

Основная статья: Трехфотонная микроскопия

Красители и флуоресцентные белки для микроскопии с двухфотонным возбуждением

В общем, все обычно используемые флуоресцентные белки (CFP, GFP, YFP, RFP) и красители можно возбуждать в двухфотонном режиме. Спектры двухфотонного возбуждения часто значительно шире, что затрудняет избирательное возбуждение флуорофоров путем переключения длин волн возбуждения. Существует несколько онлайн-баз данных двухфотонных спектров, доступных в Корнельском университете [1] и в Национальном институте химической физики и биофизики в Эстонии.

Сообщалось о нескольких красителях, излучающих зеленый, красный и БИК (зонды и реактивные метки) с чрезвычайно высокими сечениями двухфотонного поглощения. Благодаря структуре типа донор-акцептор-донор сквараиновые красители, такие как Seta-670, Seta-700 и Seta-660, демонстрируют очень высокую эффективность 2-фотонного поглощения (2PA) по сравнению с другими красителями, SeTau-647 и SeTau-665., новый тип скварин- ротаксана, демонстрирует чрезвычайно высокое сечение двухфотонного действия до 10 000 Гм в ближней ИК-области, непревзойденное для любого другого класса органических красителей.

Смотрите также

Источники

использованная литература

внешние ссылки

Последняя правка сделана 2023-04-22 02:41:30
Содержание доступно по лицензии CC BY-SA 3.0 (если не указано иное).
Обратная связь: support@alphapedia.ru
Соглашение
О проекте