Протеомика сверху вниз

Протеомика сверху вниз - это метод идентификация белка, при которой используется либо масс-спектрометр с захватом ионов для хранения изолированного иона белка для измерения массы, и тандемная масс-спектрометрия (МС / МС) или другие методы очистки белка, такие как двумерный гель-электрофорез в сочетании с МС / МС. Нисходящая протеомика способна идентифицировать и количественно определять уникальные протеоформы посредством анализа интактных белков. Название происходит от похожего подхода к секвенированию ДНК. Во время масс-спектрометрии интактные белки обычно ионизируются ионизацией электрораспылением и захватываются ионно-циклотронным резонансом с преобразованием Фурье (ловушка Пеннинга ), квадрупольная ионная ловушка (ловушка Пауля) или масс-спектрометр Orbitrap. Фрагментация для тандемной масс-спектрометрии осуществляется с помощью диссоциации с захватом электронов или диссоциации с переносом электрона. Эффективное фракционирование имеет решающее значение для обработки образцов перед протеомикой на основе масс-спектрометрии. Протеомный анализ обычно включает переваривание интактных белков с последующей идентификацией предполагаемых белков с использованием масс-спектрометрии (МС). Негелевая протеомика с нисходящей МС исследует структуру белка путем измерения неповрежденной массы с последующей прямой диссоциацией ионов в газовой фазе.

.

• 1 Преимущества
• 2 Недостатки
• 3 Исследования и использование
• 4 См. Также
• 5 Ссылки
• 6 Библиография

• Основные преимущества нисходящего подхода включают способность обнаруживать продукты деградации, изоформы белка, последовательность варианты, комбинации посттрансляционных модификаций, а также упрощенные процессы для нормализации и количественной оценки данных.
• Протеомика «сверху вниз» в сочетании с электрофорезом в полиакриламидном геле может помочь дополнить протеомный подход «снизу вверх». Нисходящие протеомные методы могут помочь выявить большие отклонения от прогнозов, и они очень успешно применялись путем комбинирования гель-элюции Фракционирование на основе жидкости с захватом Электрофорез фракционирование, осаждение белков и ВЭЖХ с обращенной фазой с ионизацией электрораспылением и МС / МС.
• Характеристика малых белков представляет собой серьезную проблему для восходящей протеомики из-за невозможности генерировать достаточное количество триптических пептидов для анализа. Протеомика «сверху вниз» позволяет обнаруживать белки с низкой массой, тем самым увеличивая репертуар известных белков. В то время как восходящая протеомика объединяет расщепленные продукты из всех протеоформ, продуцируемых геном, в единую пептидную карту продукта полноразмерного гена для табулирования и количественной оценки экспрессируемых белков, основная сила нисходящей протеомики заключается в том, он позволяет исследователям количественно отслеживать одну или несколько протеоформ из нескольких образцов и вырезать эти протеоформы для химического анализа.

• В недавнем прошлом подход «сверху вниз» сводился к анализу отдельных белков или простых смесей, тогда как сложные смеси и белки были проанализированы более устоявшимися методами, такими как восходящая протеомика. Кроме того, идентификация белков и характеристика протеоформ в подходе TDP (протеомика сверху вниз) может страдать от проблемы динамического диапазона, когда одни и те же высокоразвитые виды многократно фрагментируются.
• Хотя протеомика сверху вниз может работать в относительно высоких условиях. Чтобы успешно составить карту покрытия протеома на большом уровне, скорость выявления новых белков после начальных раундов довольно резко снижается.
• Протеомный опрос сверху вниз может преодолеть проблемы для идентификации отдельных белков, но не был достигнут в большом масштабе из-за отсутствия методов фракционирования интактного белка, интегрированных с тандемной масс-спектрометрией.

Исследование первое: количественное определение и идентификация тысяч протеоформ человека ниже 30 кДа

• Исследователи выполнили в исследовании протеоформ человека ниже 30 кДа использовались первичные фибробласты человека IMR90, содержащие конструкцию с функцией Ras, которые были выращены в среде.
• Выберите для использования Top-Down Pr отеомики для характеристики этих протеоформ, потому что в настоящее время это лучший метод для интактных белков, поскольку я обсуждал, что метод снизу вверх переваривает белок и не дает четкого изображения отдельных интактных протеоформ.
• Протеомика сверху вниз. способен идентифицировать и количественно определять уникальные протеоформы посредством анализа интактных белков. Количественный анализ сверху вниз выявил изменения в количестве 1038 цитоплазматических протеоформ.

Исследование второе: сочетание высокопроизводительной масс-спектрометрии MALDI-TOF и изоэлектрического фокусирующего гель-электрофореза для виртуальной двумерной протеомики на основе геля

• Исследователи использовали протеомику сверху вниз потому что может идентифицировать точные протеоформы интактных белков, а не восходящий подход, который дает фрагментные ионы пептидов.
• В этом исследовании использовался виртуальный 2D гель вместе с масс-спектрометрией для разделения смесей белков. MALDI - это компьютерное программное обеспечение, которое генерирует неповрежденные массы белков в каждой изоэлектрической точке. Все началось с изображения выделенного геля IPG-IEF (изоэлектрическое фокусирование), которое затем было проанализировано с помощью MALDI.
• Протеомика сверху вниз MALDI-TOF / TOF-MS более устойчива к примесям; не требует извлечения, очистки и разделения биомаркеров; и может применяться непосредственно к интактным микроорганизмам.

• Масс-спектрометрия белков
• Протеомика снизу вверх
• Протеомика дробовика
• Тандемная масс-спектрометрия (МС / МС)