Войти
A квадрупольный времяпролетный гибридный тандемный масс-спектрометр. Тандемная масс-спектрометрия, также известный как MS / MS или MS, представляет собой метод инструментального анализа, в котором используются два или более масс-анализатора. соединены вместе с использованием дополнительной стадии реакции для увеличения их возможностей анализировать химические образцы. Обычно тандем-МС используется для анализа биомолекул, таких как белки и пептиды.
. молекулы данного образца ионизирован, и первый спектрометр (обозначенный MS1 ) разделяет эти ионы на их отношение массы к заряду (часто обозначаемое как m / z или m / Q). Ионы с определенным соотношением m / z, поступающие из MS1, выбираются и затем делятся на более мелкие ионы-фрагменты , например посредством диссоциации, вызванной столкновением, ионно-молекулярной реакции или фотодиссоциации. Затем эти фрагменты вводятся во второй масс-спектрометр (MS2 ), который, в свою очередь, разделяет фрагменты по их соотношению m / z и обнаруживает их. Этап фрагментации позволяет идентифицировать и разделять ионы, которые имеют очень похожие отношения m / z в обычных масс-спектрометрах.
Тандемная масс-спектрометрия включает тройной квадруполь масс-спектрометр (qqq), квадрупольный время пролета (Q-tof) и гибридный масс-спектрометр
Тройные квадрупольные масс-спектрометры используют первый и третий квадруполи в качестве масс-фильтров. Когда аналиты проходят второй квадруполь, фрагментация происходит за счет столкновения с газом. Обычно используется в фармацевтической промышленности.
Q-tof масс-спектрометр сочетает в себе TOF и квадрупольные приборы, которые обеспечивают высокую точность определения массы для ионов продукта, возможность точного количественного определения и применимость экспериментов по фрагментации. Это метод масс-спектрометрии, в котором отношение ионной фрагментации (m / z) определяется путем измерения времени пролета.
Гибридный масс-спектрометр состоит из более чем двух масс-анализаторов.
Схема тандемной масс-спектрометрии Многоступенчатое разделение масс-анализа может быть выполнено с отдельными элементами масс-спектрометра, разделенными в пространстве, или с использованием одного масс-спектрометра с разделением этапов масс-спектрометрии во времени. Для тандемной масс-спектрометрии в космосе различные элементы часто обозначаются сокращенно, указывая тип используемого масс-селектора .
Тройная квадрупольная диаграмма; и пример тандемной масс-спектрометрии в космосе. В тандемной масс-спектрометрии в космосе элементы разделения физически разделены и различны, хотя существует физическая связь между элементами для поддержания высокого вакуума. Этими элементами могут быть секторы, квадруполь передачи или время пролета. При использовании нескольких квадруполей они могут действовать как масс-анализаторы, и как камеры столкновений.
Общее обозначение масс-анализаторов: Q - квадрупольный масс-анализатор ; q - радиочастота столкновительный квадруполь; TOF - времяпролетный масс-анализатор; B - магнитный сектор, а E - электрический сектор. Обозначения могут быть объединены для обозначения различных гибридных приборов, например QqQ '- тройной квадрупольный масс-спектрометр ; QTOF - квадрупольный времяпролетный масс-спектрометр (также QqTOF); и BEBE - четырехсекторный (обратная геометрия) масс-спектрометр.
Масс-спектрометр с ионной ловушкой является примером тандемной масс-спектрометрии во времени. Выполняя тандемную масс-спектрометрию во времени, разделение достигается за счет захваченных ионами ионов место, с несколькими этапами разделения, происходящими с течением времени. Для такого анализа можно использовать прибор квадрупольной ионной ловушки или ионно-циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (FTICR). Инструменты для улавливания могут выполнять несколько этапов анализа, который иногда называют МС (от MS к n). Часто количество шагов n не указывается, но иногда указывается значение; например MS указывает на три стадии разделения. В приборах тандемно-временной МС не используются режимы, описанные ниже, но обычно собирается вся информация из сканирования ионов-предшественников и сканирования исходного иона всего спектра. Каждая инструментальная конфигурация использует уникальный режим массовой идентификации.
Когда тандемная МС выполняется с расчетом в космосе, прибор должен работать в одном из множества режимов. Существует ряд различных экспериментальных установок тандемной МС / МС, и каждый режим имеет свои собственные приложения и предоставляет различную информацию. Тандемная МС в космосе использует соединение двух компонентов прибора, которые измеряют один и тот же диапазон масс-спектра, но с контролируемым фракционированием между ними в пространстве, тогда как тандемная МС во времени включает использование ионной ловушки.
Есть четыре основных Возможны сканирующие эксперименты с использованием МС / МС: сканирование ионов предшественников, сканирование ионов продуктов, сканирование нейтральных потерь и мониторинг выбранных реакций.
Для сканирования ионов-предшественников ион-продукт выбирается во втором масс-анализаторе, а массы предшественников сканируются в первом масс-анализаторе. Обратите внимание, что ион-предшественник является синонимом родительского иона, а ион-продукт - дочернего иона; однако использование этих антропоморфных терминов не приветствуется.
При сканировании ионов продукта на первом этапе выбирается ион-предшественник, дается возможность фрагментации, а затем все полученные массы сканируются во втором масс-анализаторе и обнаруживаются в детектор, расположенный после второго масс-анализатора. Этот эксперимент обычно проводится для определения переходов, используемых для количественной оценки тандемной МС.
При сканировании нейтральных потерь первый масс-анализатор сканирует все массы. Второй масс-анализатор также сканирует, но с заданным смещением от первого масс-анализатора. Это смещение соответствует нейтральным потерям, которые обычно наблюдаются для этого класса соединений. При сканировании с постоянной нейтралью отслеживаются все прекурсоры, которые теряют заданную общую нейтраль. Для получения этой информации оба масс-анализатора сканируются одновременно, но со смещением массы, которое коррелирует с массой указанной нейтрали. Подобно сканированию ионов-предшественников, этот метод также полезен для селективной идентификации близкородственных классов соединений в смеси.
При мониторинге выбранной реакции оба масс-анализатора настроены на выбранную массу. Этот режим аналогичен выбранному ионному мониторингу для экспериментов МС. Режим селективного анализа, который может повысить чувствительность.
Фрагментация ионов газовой фазы важна для тандемной масс-спектрометрии и происходит между различными стадиями масс-анализа. Существует множество методов, используемых для фрагментации ионов, и они могут приводить к различным типам фрагментации и, следовательно, к разной информации о структуре и составе молекулы.
Часто процесс ионизации является достаточно интенсивным, чтобы оставлять образующиеся ионы с достаточной внутренней энергией для фрагментации в массе спектрометр. Если ионы продукта сохраняются в своем неравновесном состоянии в течение умеренного времени до самодиссоциации, этот процесс называется метастабильной фрагментацией. Фрагментация сопло-скиммер относится к целенаправленной индукции фрагментации в источнике путем увеличения потенциала сопло-скиммер на инструментах, обычно основанных на электрораспылении. Хотя фрагментация в источнике позволяет проводить анализ фрагментации, технически это не тандемная масс-спектрометрия, если только метастабильные ионы не подвергаются масс-анализу или не отбираются перед самодиссоциацией, и на полученных фрагментах не выполняется второй этап анализа. Фрагментация в источнике может использоваться вместо тандемной масс-спектрометрии за счет использования технологии Enhanced in-Source Fragmentation Annotation (EISA), которая генерирует фрагментацию, которая напрямую соответствует данным тандемной масс-спектрометрии. Фрагменты, наблюдаемые EISA, имеют более высокую интенсивность сигнала, чем традиционные фрагменты, которые несут потери в ячейках столкновения тандемных масс-спектрометров. EISA обеспечивает сбор данных фрагментации на масс-анализаторах MS1, таких как времяпролетные и одноквадрупольные приборы. Фрагментация в источнике часто используется в дополнение к тандемной масс-спектрометрии (с фрагментацией после источника), чтобы учесть две стадии фрагментации в эксперименте псевдо-МС-типа.
Фрагментация после источника - это наиболее часто то, что используется в тандемном масс-спектрометрическом эксперименте. Энергия также может быть добавлена к ионам, которые обычно уже колебательно возбуждены, за счет столкновений с нейтральными атомами или молекулами после источника, поглощения излучения или переноса или захвата электрона многозарядным ионом. Диссоциация, вызванная столкновениями (CID), также называемая диссоциацией, активируемой столкновениями (CAD), включает столкновение иона с нейтральным атомом или молекулой в газовой фазе и последующую диссоциацию иона. Например, рассмотрим
, где ион AB сталкивается с нейтральным компонентом M и затем распадается на части. Детали этого процесса описываются теорией столкновений. Из-за разной аппаратной конфигурации два основных разных типа CID возможны: (i) пучковый (в котором ионы-предшественники фрагментируются в процессе полета) и (ii) тип ионной ловушки (при котором ионы-предшественники сначала захватываются, а затем фрагментируются).
Третий и более поздний тип фрагментации CID - это столкновительная диссоциация с более высокой энергией (HCD). HCD - это метод CID, характерный для масс-спектрометров с орбитальной ловушкой , в которых фрагментация происходит вне иона. ловушку, это происходит в ячейке HCD (в некоторых приборах, называемых "ионная маршрутизация, мульти столб"). HCD представляет собой фрагментацию типа ловушки, которая, как было показано, обладает характеристиками типа пучка.
Энергия, выделяемая при передаче или захвате электрона многозарядным ион может вызвать фрагментацию.
Если электрон добавляется к многозарядному положительному иону, высвобождается кулоновская энергия. Добавление свободного электрона называется диссоциацией при захвате электрона (ECD) и обозначается как
![{\displaystyle [{\ce {M}}+n{\ce {H}}]^{n+}+{\ce {e^{-}->}} \ left [[{\ ce {M}} + (n-1) {\ ce {H}}] ^ {(n-1) +} \ right] ^ {*} {\ ce {->fragments}}}]( https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/80535d501352b7854827d81bd70a7811d203d639 )
для многократно протонированной молекулы M.
Добавление электрона посредством ион-ионной реакции называется диссоциацией с переносом электрона (ETD). диссоциация с захватом электронов, ETD вызывает фрагментацию катионов (например, пептидов или белков ) путем передачи им электронов. Он был изобретен Дональдом Ф. Хант, Джошуа Кун, Джон Э.П. Сайка и Джаррод М. arto из Университета Вирджинии.
ETD не использует свободные электроны, а использует анион-радикалы (например, антрацен или азобензол ) для этой цели:
![{\displaystyle [{\ce {M}}+n{\ce {H}}]^{n+}+{\ce {A^{-}->}} \ left [[{\ ce {M}} + (n-1) {\ ce {H}}] ^ {(n-1) +} \ right] ^ {*} + {\ ce {A->фрагменты}}}]( https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/a0f39c0e76fd3f9d3862b8b49cb144a43c1cd907 )
где A - анион.
ETD расщепляется случайным образом вдоль основной цепи пептида (ионы c и z), в то время как боковые цепи и модификации, такие как фосфорилирование, остаются нетронутыми. Методика работает только при более высоком заряде состояния ионов (z>2), однако по сравнению с диссоциацией, индуцированной столкновением (CID), ETD является преимуществом для фрагментации более длинных пептидов или даже целых белков. Это делает этот метод важным для top- вниз протеомика. Как и ECD, ETD действует Для пептидов с модификациями, такими как фосфорилирование.
Диссоциация с переносом электрона и столкновением с более высокой энергией (EThcD) представляет собой комбинацию ETD и HCD, где предшественник пептида первоначально подвергается действию иона / ионная реакция с анионами флуорантена в линейной ионной ловушке, которая генерирует c- и z-ионы. На втором этапе полностью ионная фрагментация HCD применяется ко всем ионам, полученным из ETD, для генерации b- и y- ионов перед окончательным анализом в анализаторе орбитальной ловушки. В этом методе используется двойная фрагментация для генерации ионно-масс-спектрометрии и, следовательно, богатых данными МС / МС-спектров для секвенирования пептидов и PTM локализации.
Фрагментация также может происходят с депротонированной разновидностью, в которой электрон переносится от разновидности к катионному реагенту при диссоциации с отрицательным переносом электрона (NETD):
![{\displaystyle [{\ce {M}}-n{\ce {H}}]^{n-}+{\ce {A+->}} \ left [[{\ ce {M}} - n {\ ce {H}}] ^ {(n + 1) -} \ right] ^ {*} + {\ ce {A->фрагменты}}}]( https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/383244602d9ce4607f68c0696b8c55fb10951a3f )
Подписка В этом случае электронодефицитный анион подвергается внутренней перегруппировке и фрагментируется. NETD является ион-ионным аналогом расслоения электронов. ociation (EDD).
NETD совместим с фрагментированием пептида и белков вдоль основной цепи по связи C α -C. Образующиеся фрагменты обычно представляют собой ионы продуктов a- и x-типа.
Диссоциация с отрывом электронов (EDD) представляет собой метод фрагментации анионных частиц в масс-спектрометрии. Он служит режимом отрицательного счетчика для диссоциации захвата электронов. Отрицательно заряженные ионы активируются облучением электронами умеренной кинетической энергии. В результате происходит выброс электронов из исходной ионной молекулы, что вызывает диссоциацию посредством рекомбинации.
Реакция между положительно заряженными пептидами и катионными реагентами, также известная как диссоциация с переносом заряда (CTD), недавно была продемонстрирована как альтернативный путь высокоэнергетической фрагментации для слабозарядных состояние (1+ или 2+) пептидов. Предлагаемый механизм CTD с использованием катионов гелия в качестве реагента:
![{\displaystyle {\ce {{[{M}+H]^{1}+}+He+->}} \ left [{\ ce {[{M} + H] ^ {2} +}} \ right] ^ {*} + {\ ce {He ^ {0} ->фрагменты}}}]( https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/ svg / a8ccd097f31299c546cd6e591efb6ed4f8556e2e )
Первоначальные сообщения заключаются в том, что CTD вызывает расщепление C α -C связи в основной цепи пептидов и обеспечивает образование ионов α- и x-типов.
Энергия, необходимая для диссоциации, может быть добавлена за счет поглощения фотона, что приводит к фотодиссоциации иона и обозначается как
где 
Инфракрасные фотоны нагревают ионы и вызывают диссоциацию, если их поглощается достаточное количество. Этот процесс называется инфракрасной многофотонной диссоциацией (IRMPD) и часто выполняется с помощью углекислотного лазера и масс-спектрометра с улавливанием ионов, такого как FTMS.
Излучение черного тела может использоваться для фотодиссоциации в методике, известной как инфракрасная радиационная диссоциация черного тела (BIRD). В методе BIRD вся вакуумная камера масс-спектрометра нагревается для создания инфракрасного света. BIRD использует это излучение для возбуждения все более энергичных колебаний ионов до тех пор, пока связь не разорвется, образуя фрагменты. Это похоже на инфракрасную многофотонную диссоциацию, в которой также используется инфракрасный свет, но из другого источника. BIRD чаще всего используется с масс-спектрометрией с ионным циклотронным резонансом с преобразованием Фурье и.
При диссоциации, индуцированной поверхностью (SID), фрагментация является результатом столкновения иона с поверхностью в высоком вакууме. Сегодня SID используется для фрагментации широкого спектра ионов. Много лет назад было принято использовать SID только для однозарядных частиц с меньшей массой, потому что методы ионизации и технологии масс-анализаторов не были достаточно развиты, чтобы должным образом формировать, передавать или характеризовать ионы с высоким m / z. Со временем самоорганизующиеся монослойные поверхности (SAM), состоящие из CF3 (CF2) 10CH2CH2S на золоте, стали наиболее часто используемыми поверхностями столкновения для SID в тандемном спектрометре. ЗРК выступали в качестве наиболее желательных мишеней для столкновений из-за их характерно больших эффективных масс для столкновения падающих ионов. Кроме того, эти поверхности состоят из жестких фторуглеродных цепочек, которые существенно не ослабляют энергию ионов-снарядов. Цепи фторуглерода также полезны из-за их способности противостоять легкому переносу электронов с поверхности металла на поступающие ионы. Способность SID создавать подкомплексы, которые остаются стабильными и предоставляют ценную информацию о связности, не имеет себе равных ни у одного другого метода диссоциации. Поскольку комплексы, полученные из SID, являются стабильными и сохраняют распределение заряда на фрагменте, это дает уникальный спектр, в котором комплекс сосредоточен вокруг более узкого распределения m / z. Продукты SID и энергия, с которой они образуются, отражают сильные стороны и топологию комплекса. Уникальные паттерны диссоциации помогают раскрыть четвертичную структуру комплекса. Симметричное распределение заряда и зависимость диссоциации уникальны для SID и делают полученные спектры отличными от любого другого метода диссоциации.
Метод SID также применим к масс-спектрометрии ионной подвижности (IM-MS). Три различных метода для этого метода включают анализ характеристик топологии, межсубъединичной связи и степени разворачивания структуры белка. Анализ разворачивания структуры белка является наиболее часто используемым применением метода SID. Для масс-спектрометрии ионной подвижности (IM-MS) SID используется для диссоциации исходных активированных предшественников трех различных типов белковых комплексов: C-реактивного белка (CRP), транстиретина (TTR) и конканавалина A (Con A).. Этот метод используется для наблюдения за степенью раскрытия каждого из этих комплексов. Для этого наблюдения SID показал структуры ионов-предшественников, которые существовали до столкновения с поверхностью. IM-MS использует SID как прямую меру конформации для каждой белковой субъединицы.
Ионно-циклотронный резонанс с преобразованием Фурье (FTICR) может обеспечить сверхвысокое разрешение и высокую точность измерения массы для приборов, которые проводят измерения массы.. Эти особенности делают масс-спектрометры FTICR полезным инструментом для широкого круга приложений, таких как несколько экспериментов по диссоциации, таких как диссоциация, вызванная столкновением (CID, диссоциация с переносом электрона (ETD) и др.). Кроме того, диссоциация, индуцированная поверхностью, была реализована с этот инструмент для изучения фундаментальной фрагментации пептидов. В частности, SID применялся для изучения энергетики и кинетики газофазной фрагментации внутри прибора ICR. Этот подход использовался для понимания газофазной фрагментации протонированных пептидов. Ионы пептидов с нечетными электронами, нековалентные комплексы лиганд-пептид и лигированные металлические кластеры.
Количественная протеомика используется для определения относительного или абсолютного количества белков в образце. Несколько методов количественной протеомики основаны на тандемной масс-спектрометрии. МС / МС стал эталонной процедурой для выяснения структуры комплекса b iomolecules.
Одним из методов, обычно используемых для количественной протеомики, является мечение изобарической меткой. Изобарическая маркировка тегов позволяет одновременно идентифицировать и количественно определять белки из нескольких образцов в одном анализе. Для количественной оценки белков пептиды помечаются химическими метками, которые имеют одинаковую структуру и номинальную массу, но различаются по распределению тяжелых изотопов в их структуре. Эти метки, обычно называемые тандемными масс-метками, сконструированы таким образом, что масс-метка расщепляется в определенной линкерной области при диссоциации, индуцированной столкновениями с более высокой энергией (HCD) во время тандемной масс-спектрометрии, давая репортерные ионы различной массы. Количественное определение белка выполняется путем сравнения интенсивностей репортерных ионов в спектрах МС / МС. Две коммерчески доступные изобарические метки - это реагенты iTRAQ и TMT.
Изобарические метки для тандемной масс-спектрометрии: белки извлекаются из клеток, перевариваются и маркируются метками той же массы. При фрагментировании во время МС / МС репортерные ионы показывают относительное количество пептидов в образцах. Изобарическая метка для относительного и абсолютного количественного определения (iTRAQ) - это реагент для тандемной масс-спектрометрии, который используется для определения количества белков из разных источников в одном эксперименте. В нем используются стабильные меченые изотопом молекулы, которые могут образовывать ковалентную связь с N-концом и аминами боковой цепи белков. Реагенты iTRAQ используются для мечения пептидов из различных образцов, которые объединяются и анализируются с помощью жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии. Фрагментация прикрепленной метки генерирует низкомолекулярный ион-репортер, который можно использовать для сравнительного количественного определения пептидов и белков, из которых они произошли.
A Тандемная метка массы (TMT) - это химическая метка изобарной массы, используемая для количественного определения и идентификации белка. Теги содержат четыре области: репортер массы, расщепляемый линкер, нормализационная масса и группа, реагирующая с белком. Реагенты TMT могут использоваться для одновременного анализа от 2 до 11 различных образцов пептидов, полученных из клеток, тканей или биологических жидкостей. Доступны три типа реагентов TMT с различной химической реакционной способностью: (1) реакционная функциональная группа сложного эфира NHS для мечения первичных аминов (TMTduplex, TMTsixplex, TMT10plex plus TMT11-131C), (2) реактивная йодацетильная функциональная группа для мечения свободных сульфгидрилов ( iodoTMT) и (3) реактивная алкоксиаминовая функциональная группа для мечения карбонилов (aminoxyTMT).
Хроматографическая кривая (вверху) и тандемный масс-спектр (внизу) пептида. Тандемная масс-спектрометрия может использоваться для секвенирования белков. Когда интактные белки вводятся в масс-анализатор, это называется «нисходящей протеомикой », а когда белки расщепляются на более мелкие пептиды и впоследствии вводятся в масс-спектрометр, это называется «восходящая протеомика ». Протеомика дробовика представляет собой вариант протеомики снизу вверх, при которой белки в смеси перевариваются перед разделением и тандемной масс-спектрометрией.
Тандемная масс-спектрометрия может дать тег пептидной последовательности, который можно использовать для идентификации пептида в базе данных белков. Обозначения были разработаны для обозначения пептидных фрагментов, которые возникают из тандемного масс-спектра. Ионы пептидных фрагментов обозначаются буквами a, b или c, если заряд сохраняется на N-конце, и x, y или z, если заряд сохраняется на C-конце. Нижний индекс указывает количество аминокислотных остатков во фрагменте. Верхние индексы иногда используются для обозначения нейтральных потерь в дополнение к фрагментации основной цепи * для потери аммиака и ° для потери воды. Хотя расщепление пептидного остова является наиболее полезным для секвенирования и идентификации пептидов, другие фрагментные ионы могут наблюдаться в условиях диссоциации при высокой энергии. К ним относятся ионы потери боковой цепи d, v, w и ионы аммония, а также дополнительные специфичные для последовательности ионы фрагментов, связанные с определенными аминокислотными остатками.
Олигосахариды могут быть секвенированы с помощью тандемной масс-спектрометрии аналогично секвенированию пептидов. Фрагментация обычно происходит по обе стороны от гликозидной связи (ионы b, c, y и z), но также и в более энергичных условиях через структуру сахарного кольца при перекрестном расщеплении кольца (ионы x). Снова конечные индексы используются для указания положения расщепления вдоль цепи. Для ионов с перекрестным расщеплением кольца природа расщепления перекрестного кольца обозначена предшествующими надстрочными индексами.
Тандемная масс-спектрометрия была применена к ДНК и РНК секвенирование. Было предложено обозначение газофазной фрагментации ионов олигонуклеотидов.
Скрининг новорожденных - это процесс тестирования новорожденных на излечимые генетические, эндокринологические, метаболические и гематологические заболевания. Развитие тандемного масс-спектрометрического скрининга в начале 1990-х привело к широкому распространению потенциально обнаруживаемых врожденных метаболических заболеваний, влияющих на уровень органических кислот в крови.
Тандемное. масс-спектрометрия не может применяться для анализа отдельных ячеек, поскольку она нечувствительна к анализу таких малых количеств ячейки. Эти ограничения в первую очередь связаны с сочетанием неэффективного производства ионов и потерь ионов в приборах из-за источников химического шума растворителей.
Тандемная масс-спектрометрия будет полезным инструментом для анализа белков. характеристика, нуклеопротеидные комплексы и другие биологические структуры. Однако остались некоторые проблемы, такие как количественный и качественный анализ характеристик протеома.
