протеаза TEV

редактировать
ядерное включение- эндопептидаза
TEV protease summary.png протеаза TEV (белый) в комплексе с пептидным субстратом (черный) с остатками триады активного центра (красный). (PDB : 1lvb ​)
Идентификаторы
Номер EC 3.4.22.44
Номер CAS 139946-51-3
Базы данных
IntEnz IntEnz view
BRENDA BRENDA entry
ExPASy NiceZyme view
KEGG KEGG entry
MetaCyc метаболический путь
PRIAM профиль
PDB структурыRCSB PDB PDBe PDBsum

протеаза TEV (EC 3.4.22.44, эндопептидаза ядерного включения вируса табачного травления) представляет собой высокоспецифичную цистеиновую протеазу из вируса травления табака (TEV). Он является членом клана PA химотрипсин -подобных протеаз. Из-за высокой специфичности последовательности его часто используют для контролируемого расщепления слитых белков in vitro и in vivo.

Содержание

  • 1 Происхождение
  • 2 Структура и функции
  • 3 Специфичность
  • 4 Как биохимический инструмент
  • 5 Ссылки
  • 6 Внешние ссылки

Происхождение

Вирус травления табака кодирует весь геном как единый массивный полипротеин (350 кДа). Он расщепляется на функциональные единицы тремя протеазами: протеазой P1 (1 сайт расщепления), протеазой вспомогательного компонента (1 сайт расщепления) и протеазой TEV (7 сайтов расщепления). Нативная протеаза TEV также содержит внутренний сайт саморасщепления. Этот сайт медленно расщепляется, чтобы инактивировать фермент (физиологическая причина этого неизвестна).

Структура и функция

Структура протеазы TEV. Двойные β-цилиндры, определяющие суперсемейство, выделены красным. (PDB : 1lvm ​)

Структура протеазы TEV была определена с помощью рентгеновской кристаллографии. Она состоит из двух β-бочек и гибкий C-концевой хвост и отображает структурную гомологию с химотрипсином суперсемейством протеаз (клан PA, семейство C4 по классификации MEROPS Хотя гомологичен клеточным сериновым протеазам (таким как трипсин, эластаза, тромбин и т. Д.), Протеаза TEV использует цистеин в качестве его каталитический нуклеофил (как и многие другие вирусные протеазы).

Ковалентный катализ осуществляется с помощью Asp-His-Cys триады, разделенной между двумя цилиндрами (Asp на β1 и His и Cys на β2). Субстрат удерживается в виде β-слоя, образуя антипараллельное взаимодействие с щелью между стволами и параллельное взаимодействие с С-концевым хвостом. Фермент, таким образом, образует связывающий туннель вокруг субстрата, и взаимодействия с боковыми цепями контролируют специфичность.

специфичность

мод поверхности el TEV, связанного с нерасщепленным субстратом (черный), также демонстрирует каталитическую триаду (красный). Субстрат связывается внутри туннеля активного сайта (слева). Вырез (справа) показывает дополнительную форму связывающего туннеля к субстрату. (PDB : 1lvb ​)

Предпочтительная последовательность нативного расщепления была сначала идентифицирована путем исследования сайтов разрезов в природном субстрате полипротеина на предмет повторяющейся последовательности. Консенсус для этих сайтов естественного разрезания - ENLYFQ \ S где '\' обозначает расщепленную пептидную связь. Остатки субстрата помечены от P6 до P1 перед сайтом разреза и P1 'после сайта разреза. В ранних работах также измерялось расщепление массива аналогичных субстратов для характеристики насколько протеаза была специфичной для нативной последовательности.

В исследованиях впоследствии использовалось секвенирование расщепленных субстратов из пула рандомизированных последовательностей для определения предпочтительных паттернов. Хотя ENLYFQ \ S является оптимальной последовательностью, протеаза активна по отношению к в большей или меньшей степени на ряде субстратов (т.е. показывает некоторую неразборчивость субстрата ). Наибольшее расщепление происходит у последовательностей, ближайших к консенсусу EXLYΦQ \ φ, где X - любой остаток, Φ - любой большой или средний гидрофоб и φ - любое небольшое гидрофобное или полярное сопротивление. idue. Хотя эта последовательность является оптимальной, последовательности с нежелательными остатками в некоторых положениях все же могут быть расщеплены, если остальная часть последовательности является оптимальной.

Специфичность обеспечивается большой площадью контакта между ферментом и субстратом. Протеазы, такие как трипсин, обладают специфичностью в отношении одного остатка до и после расщепленной связи из-за неглубокой связывающей щели только с одним или двумя карманами, которые связывают боковые цепи субстрата. Напротив, вирусные протеазы, такие как протеаза TEV, имеют длинный С-концевой хвост, который полностью покрывает субстрат, создавая туннель связывания. Этот туннель содержит набор плотно связывающихся карманов, так что каждая боковая цепь пептида-субстрата (от P6 до P1 ') связана в комплементарном сайте (от S6 до S1').

В частности, боковая цепь пептида P6 -Glu контактирует с сетью из трех водородных связей; P5-Asn указывает на растворитель, не производя специфических взаимодействий (отсюда отсутствие консенсуса по субстрату в этом положении); P4-Leu находится в гидрофобном кармане; P3-Tyr находится в гидрофобном кармане с короткой водородной связью на конце; P2-Phe также окружен гидрофобами, включая лицевую сторону триады гистидина; P1-Gln образует четыре водородные связи; и P1'-Ser лишь частично заключен в неглубокую гидрофобную бороздку.

В качестве биохимического инструмента

Одно из основных применений этого белка - удаление аффинных меток из очищенных рекомбинантных слитых белков. Причиной использования протеазы TEV в качестве биохимического инструмента является ее высокая специфичность последовательности. Эта специфичность позволяет контролировать расщепление белков, когда предпочтительную последовательность вставляют в гибкие петли. Это также делает его относительно нетоксичным in vivo, поскольку распознаваемая последовательность редко встречается в белках.

Хотя рациональный дизайн не привел к ограниченному успеху в изменении специфичности протеазы, направленная эволюция использовалась для изменения предпочтительный остаток до или после сайта расщепления.

Однако протеаза TEV имеет ограничения как биохимический инструмент. Он склонен к дезактивации за счет саморасщепления (автолиза), хотя его можно отменить с помощью единственной мутации S219V во внутреннем сайте расщепления. Выраженная отдельно протеаза также плохо растворима, однако было предпринято несколько попыток улучшить ее растворимость с помощью направленной эволюции и компьютерного дизайна. Также было показано, что экспрессия может быть улучшена путем слияния с мальтозосвязывающим белком (MBP), который действует как партнер, повышающий растворимость.

Молекулярная масса этого фермента варьируется от 25 до 27 кДа в зависимости от конкретной используемой конструкции.

Ссылки

Внешние ссылки

Последняя правка сделана 2021-06-09 05:47:07
Содержание доступно по лицензии CC BY-SA 3.0 (если не указано иное).
Обратная связь: support@alphapedia.ru
Соглашение
О проекте