ядерное включение- эндопептидаза | |||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
протеаза TEV (белый) в комплексе с пептидным субстратом (черный) с остатками триады активного центра (красный). (PDB : 1lvb ) | |||||||||
Идентификаторы | |||||||||
Номер EC | 3.4.22.44 | ||||||||
Номер CAS | 139946-51-3 | ||||||||
Базы данных | |||||||||
IntEnz | IntEnz view | ||||||||
BRENDA | BRENDA entry | ||||||||
ExPASy | NiceZyme view | ||||||||
KEGG | KEGG entry | ||||||||
MetaCyc | метаболический путь | ||||||||
PRIAM | профиль | ||||||||
PDB структуры | RCSB PDB PDBe PDBsum | ||||||||
|
протеаза TEV (EC 3.4.22.44, эндопептидаза ядерного включения вируса табачного травления) представляет собой высокоспецифичную цистеиновую протеазу из вируса травления табака (TEV). Он является членом клана PA химотрипсин -подобных протеаз. Из-за высокой специфичности последовательности его часто используют для контролируемого расщепления слитых белков in vitro и in vivo.
Вирус травления табака кодирует весь геном как единый массивный полипротеин (350 кДа). Он расщепляется на функциональные единицы тремя протеазами: протеазой P1 (1 сайт расщепления), протеазой вспомогательного компонента (1 сайт расщепления) и протеазой TEV (7 сайтов расщепления). Нативная протеаза TEV также содержит внутренний сайт саморасщепления. Этот сайт медленно расщепляется, чтобы инактивировать фермент (физиологическая причина этого неизвестна).
Структура протеазы TEV была определена с помощью рентгеновской кристаллографии. Она состоит из двух β-бочек и гибкий C-концевой хвост и отображает структурную гомологию с химотрипсином суперсемейством протеаз (клан PA, семейство C4 по классификации MEROPS Хотя гомологичен клеточным сериновым протеазам (таким как трипсин, эластаза, тромбин и т. Д.), Протеаза TEV использует цистеин в качестве его каталитический нуклеофил (как и многие другие вирусные протеазы).
Ковалентный катализ осуществляется с помощью Asp-His-Cys триады, разделенной между двумя цилиндрами (Asp на β1 и His и Cys на β2). Субстрат удерживается в виде β-слоя, образуя антипараллельное взаимодействие с щелью между стволами и параллельное взаимодействие с С-концевым хвостом. Фермент, таким образом, образует связывающий туннель вокруг субстрата, и взаимодействия с боковыми цепями контролируют специфичность.
Предпочтительная последовательность нативного расщепления была сначала идентифицирована путем исследования сайтов разрезов в природном субстрате полипротеина на предмет повторяющейся последовательности. Консенсус для этих сайтов естественного разрезания - ENLYFQ \ S где '\' обозначает расщепленную пептидную связь. Остатки субстрата помечены от P6 до P1 перед сайтом разреза и P1 'после сайта разреза. В ранних работах также измерялось расщепление массива аналогичных субстратов для характеристики насколько протеаза была специфичной для нативной последовательности.
В исследованиях впоследствии использовалось секвенирование расщепленных субстратов из пула рандомизированных последовательностей для определения предпочтительных паттернов. Хотя ENLYFQ \ S является оптимальной последовательностью, протеаза активна по отношению к в большей или меньшей степени на ряде субстратов (т.е. показывает некоторую неразборчивость субстрата ). Наибольшее расщепление происходит у последовательностей, ближайших к консенсусу EXLYΦQ \ φ, где X - любой остаток, Φ - любой большой или средний гидрофоб и φ - любое небольшое гидрофобное или полярное сопротивление. idue. Хотя эта последовательность является оптимальной, последовательности с нежелательными остатками в некоторых положениях все же могут быть расщеплены, если остальная часть последовательности является оптимальной.
Специфичность обеспечивается большой площадью контакта между ферментом и субстратом. Протеазы, такие как трипсин, обладают специфичностью в отношении одного остатка до и после расщепленной связи из-за неглубокой связывающей щели только с одним или двумя карманами, которые связывают боковые цепи субстрата. Напротив, вирусные протеазы, такие как протеаза TEV, имеют длинный С-концевой хвост, который полностью покрывает субстрат, создавая туннель связывания. Этот туннель содержит набор плотно связывающихся карманов, так что каждая боковая цепь пептида-субстрата (от P6 до P1 ') связана в комплементарном сайте (от S6 до S1').
В частности, боковая цепь пептида P6 -Glu контактирует с сетью из трех водородных связей; P5-Asn указывает на растворитель, не производя специфических взаимодействий (отсюда отсутствие консенсуса по субстрату в этом положении); P4-Leu находится в гидрофобном кармане; P3-Tyr находится в гидрофобном кармане с короткой водородной связью на конце; P2-Phe также окружен гидрофобами, включая лицевую сторону триады гистидина; P1-Gln образует четыре водородные связи; и P1'-Ser лишь частично заключен в неглубокую гидрофобную бороздку.
Одно из основных применений этого белка - удаление аффинных меток из очищенных рекомбинантных слитых белков. Причиной использования протеазы TEV в качестве биохимического инструмента является ее высокая специфичность последовательности. Эта специфичность позволяет контролировать расщепление белков, когда предпочтительную последовательность вставляют в гибкие петли. Это также делает его относительно нетоксичным in vivo, поскольку распознаваемая последовательность редко встречается в белках.
Хотя рациональный дизайн не привел к ограниченному успеху в изменении специфичности протеазы, направленная эволюция использовалась для изменения предпочтительный остаток до или после сайта расщепления.
Однако протеаза TEV имеет ограничения как биохимический инструмент. Он склонен к дезактивации за счет саморасщепления (автолиза), хотя его можно отменить с помощью единственной мутации S219V во внутреннем сайте расщепления. Выраженная отдельно протеаза также плохо растворима, однако было предпринято несколько попыток улучшить ее растворимость с помощью направленной эволюции и компьютерного дизайна. Также было показано, что экспрессия может быть улучшена путем слияния с мальтозосвязывающим белком (MBP), который действует как партнер, повышающий растворимость.
Молекулярная масса этого фермента варьируется от 25 до 27 кДа в зависимости от конкретной используемой конструкции.