Войти
| Просмотр / редактирование человека | Просмотр / редактирование мыши |
обратная транскриптаза теломеразы (сокращенно TERT или hTERT у людей) является каталитическим субъединица фермента теломеразы, которая вместе с компонентом теломеразной РНК (TERC) составляет наиболее важную единицу комплекса теломеразы.
Теломеразы являются частью отдельной подгруппы РНК-зависимых полимераз. Теломераза удлиняет теломеры в цепях ДНК, тем самым позволяя стареющим клеткам, которые в противном случае стали бы постмитотическими и подверглись апоптозу, превысить предел Хейфлика и стать потенциально бессмертен, как это часто бывает с раковыми клетками. Чтобы быть конкретным, TERT отвечает за катализирование добавления нуклеотидов в последовательности TTAGGG к концам теломер хромосомы . Это добавление повторяющихся последовательностей ДНК предотвращает деградацию концов хромосом после нескольких циклов репликации.
Отсутствие hTERT (обычно в результате мутации хромосомы ) ассоциируется с заболеванием Cri du chat.
Теломераза представляет собой рибонуклеопротеин полимеразу, которая поддерживает концы теломер путем добавления теломерного повтора TTAGGG. Фермент состоит из белкового компонента с активностью обратной транскриптазы, кодируемого этим геном, и компонента РНК, который служит матрицей для теломерного повтора. Экспрессия теломеразы играет роль в клеточном старении, поскольку она обычно подавляется в постнатальных соматических клетках, что приводит к прогрессивному укорачиванию теломер. Исследования на мышах предполагают, что теломераза также участвует в репарации хромосом, поскольку синтез de novo теломер повторов может происходить в двухцепочечных разрывах. Были идентифицированы альтернативно сплайсированные варианты, кодирующие различные изоформы обратной транскриптазы теломеразы; полноразмерная последовательность некоторых вариантов не определена. Альтернативный сплайсинг в этом локусе считается одним из механизмов регуляции активности теломеразы.
Ген hTERT, расположенный на хромосоме 5, состоит из 16 экзонов и 15 интронов размером 35 т.п.н. Основной промотор hTERT включает 330 пар оснований перед сайтом начала трансляции (AUG, поскольку это РНК с использованием слов «экзоны» и «интроны»), а также 37 пар оснований экзона 2 гена hTERT. Промотор hTERT является GC-богатым и не имеет блоков TATA и CAAT, но содержит много сайтов для нескольких факторов транскрипции, что указывает на высокий уровень регуляции множеством факторов. во многих сотовых контекстах. Факторы транскрипции, которые могут активировать hTERT, включают многие онкогены (вызывающие рак гены), такие как c-Myc, Sp1, HIF-1, AP2 и многие другие, в то время как многие гены, подавляющие рак, такие как p53, WT1 и Menin, производят факторы, подавляющие активность hTERT. Другой формой активации является деметилирование гистонов проксимальнее области промотора, имитируя низкую плотность триметилированных гистонов, наблюдаемую в эмбриональных стволовых клетках.. Это позволяет задействовать гистонацетилтрансферазу (HAT) для раскрутки последовательности, обеспечивающей транскрипцию гена.
Дефицит теломер часто связан со старением, раком и состояниями дискератозом. congenita (DKC) и Cri du chat. Между тем, сверхэкспрессия hTERT часто ассоциируется с раком и образованием опухолей. Регуляция hTERT чрезвычайно важна для поддержания стволовых и раковых клеток и может использоваться множеством способов в области регенеративной медицины.
hTERT часто активируется в клетках, которые быстро делятся, включая как эмбриональные стволовые клетки, так и взрослые стволовые клетки. Он удлиняет теломеры стволовых клеток, что, как следствие, увеличивает продолжительность жизни стволовых клеток, обеспечивая неопределенное деление без укорачивания теломер. Следовательно, он отвечает за самообновляющиеся свойства стволовых клеток. Обнаружено, что теломераза специфически нацелена на более короткие теломеры по сравнению с более длинными теломерами из-за различных регуляторных механизмов внутри клеток, которые снижают сродство теломеразы к более длинным теломерам. Это предпочтительное сродство поддерживает баланс внутри клетки, так что теломеры имеют достаточную длину для их функции и в то же время не вносят вклад в аберрантное удлинение теломер
Высокая экспрессия hTERT также часто используется в качестве ориентир для состояния плюрипотентности и мультипотентности эмбриональных и взрослых стволовых клеток. Было обнаружено, что сверхэкспрессия hTERT увековечивает определенные типы клеток, а также придает различные интересные свойства различным стволовым клеткам.
hTERT увековечивает различные нормальные клетки в культуре, тем самым наделяя не стволовые культуры свойством самообновления. Есть несколько способов, которыми может быть достигнуто иммортализация нестволовых клеток, одним из которых является введение hTERT в клетки. Дифференцированные клетки часто экспрессируют hTERC и TP1, белок, связанный с теломеразой, который помогает формировать сборку теломеразы, но не экспрессирует hTERT. Следовательно, hTERT действует как ограничивающий фактор для активности теломеразы в дифференцированных клетках. Однако при сверхэкспрессии hTERT активная теломераза может образовываться в дифференцированных клетках. Этот метод использовался для иммортализации эпителиальных и стромальных клеток простаты, которые обычно трудно культивировать in vitro. Введение hTERT позволяет культивировать эти клетки in vitro и доступно для возможных будущих исследований. Введение hTERT имеет преимущество перед использованием вирусного белка для иммортализации в том, что оно не включает инактивацию гена-супрессора опухоли, который может привести к образованию рака.
Чрезмерная экспрессия hTERT в стволовых клетках изменяет свойства клеток. Сверхэкспрессия hTERT увеличивает свойства стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток человека. Профиль экспрессии мезенхимальных стволовых клеток сходится к эмбриональным стволовым клеткам, предполагая, что эти клетки могут обладать свойствами, подобными эмбриональным стволовым клеткам. Однако было обнаружено, что мезенхимальные стволовые клетки подвергаются пониженным уровням спонтанной дифференцировки. Это предполагает, что способность к дифференцировке взрослых стволовых клеток может зависеть от активности теломеразы. Следовательно, сверхэкспрессия hTERT, которая сродни увеличению активности теломеразы, может создавать взрослые стволовые клетки с большей способностью к дифференцировке и, следовательно, с большей способностью к лечению.
Повышение активности теломеразы в стволовых клетках дает различные эффекты в зависимости от внутренней природы различных типов стволовых клеток. Следовательно, не все стволовые клетки обладают улучшенными свойствами стволовых клеток. Например, исследования показали, что теломераза может активироваться в CD34 + клетках пуповинной крови за счет сверхэкспрессии hTERT. Выживаемость этих стволовых клеток была увеличена, хотя не было увеличения количества удвоения популяции.
Дерегуляция экспрессии теломеразы в соматических клетках может быть вовлечена в онкогенез..
Полногеномные исследования ассоциации показывают, что TERT является геном восприимчивости к развитию многих видов рака, включая рак легких.
Активность теломеразы связана с тем, сколько раз клетка могут делиться, играя важную роль в бессмертии клеточных линий, таких как раковые клетки. Комплекс фермента действует путем добавления теломерных повторов к концам хромосомной ДНК. Это порождает бессмертные раковые клетки. Фактически, существует сильная корреляция между активностью теломеразы и злокачественными опухолями или линиями раковых клеток. Не все типы рака человека обладают повышенной активностью теломеразы. 90% раковых заболеваний характеризуются повышенной активностью теломеразы. Рак легких является наиболее хорошо изученным типом рака, связанным с теломеразой. Отсутствует существенная активность теломеразы в некоторых типах клеток, таких как первичные человеческие фибробласты, которые становятся стареющими примерно после 30-50 удвоений популяции. Есть также свидетельства того, что активность теломеразы увеличивается в тканях, таких как линии зародышевых клеток, которые являются самообновляющимися. С другой стороны, нормальные соматические клетки не обладают детектируемой теломеразной активностью. Поскольку каталитическим компонентом теломеразы является ее обратная транскриптаза, hTERT, и компонент РНК hTERC, hTERT является важным геном, который необходимо исследовать с точки зрения рака и туморогенеза.
Ген hTERT был исследован для мутаций и их связи с риском заболеть раком. Обнаружено более двухсот комбинаций полиморфизма hTERT и развития рака. Было задействовано несколько различных типов рака, и сила корреляции между полиморфизмом и развитием рака варьировалась от слабой до сильной. Регуляция hTERT также была исследована для определения возможных механизмов активации теломеразы в раковых клетках. Важно отметить, что мутации в промоторе hTERT были впервые идентифицированы при меланоме, и впоследствии было показано, что они являются наиболее частыми некодирующими мутациями при раке. Киназа гликогенсинтазы 3 (GSK3 ), по-видимому, чрезмерно экспрессируется в большинстве раковых клеток. GSK3 участвует в активации промотора посредством управления сетью из факторов транскрипции. Лептин также участвует в повышении экспрессии мРНК hTERT через сигнальный преобразователь и активацию транскрипции 3 (STAT3 ), предлагая механизм увеличения заболеваемости раком у людей с ожирением. Существует несколько других регуляторных механизмов, которые изменяются или аберрантны в раковых клетках, включая сигнальный путь Ras и другие регуляторы транскрипции. Фосфорилирование также является ключевым процессом посттранскрипционной модификации, которая регулирует Экспрессия мРНК и клеточная локализация. Очевидно, что существует множество регуляторных механизмов активации и репрессии активности hTERT и теломеразы в клетке, обеспечивающих методы иммортализации раковых клеток.
Если повышенная активность теломеразы связана с злокачественным новообразованием, тогда возможное лечение рака может включать ингибирование его каталитического компонента, hTERT, для уменьшения активности фермента и вызывают гибель клеток. Поскольку нормальные соматические клетки не экспрессируют TERT, ингибирование теломеразы в раковых клетках может вызывать старение и апоптоз, не затрагивая нормальные клетки человека. Было обнаружено, что доминантно-отрицательные мутанты hTERT могут снижать активность теломеразы в клетке. Это привело к апоптозу и гибели клеток в клетках с короткой длиной теломер, что является многообещающим результатом для лечения рака. Хотя клетки с длинными теломерами не испытали апоптоза, они приобрели смертные характеристики и подверглись укорочению теломер. Также было обнаружено, что активность теломеразы подавляется фитохимическими веществами, такими как изопреноиды, генистеин, куркумин и т. Д. Эти химические вещества играют роль в ингибировании пути mTOR посредством подавления фосфорилирования. Путь mTOR очень важен для регуляции синтеза белка и взаимодействует с теломеразой, увеличивая ее экспрессию. Было обнаружено, что некоторые другие химические вещества подавляют активность теломеразы и в настоящее время проходят испытания в качестве потенциальных вариантов клинического лечения, например, аналоги нуклеозидов, производные ретиноевой кислоты, хинолоновые антибиотики, и производные катехина. Существуют также другие молекулярно-генетические методы ингибирования теломеразы, такие как антисмысловая терапия и РНК-интерференция.
hTERT пептид, которые, как было показано, индуцируют цитотоксическая Т-клеточная реакция против теломеразоположительных опухолевых клеток in vitro. Ответ опосредован дендритными клетками, которые могут отображать hTERT-ассоциированные антигены на MHC рецепторах I и II класса после аденовирусов <36.>трансдукция плазмиды hTERT в дендритные клетки, которые опосредуют ответы Т-клеток. Затем дендритные клетки могут представлять связанные с теломеразой антигены даже с неопределяемым количеством теломеразной активности, пока присутствует плазмида hTERT. Иммунотерапия против теломеразоположительных опухолевых клеток является многообещающим область исследований рака, эффективность которой была подтверждена в исследованиях in vitro и модели мыши.
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS-клетки) представляют собой соматические клетки, которые были перепрограммированы в стволовые клетки -подобное состояние путем введения четырех факторов (Oct3 / 4, Sox2, Klf4 и c-Myc ). iPS-клетки обладают способностью самообновляться на неопределенный срок и вносят вклад во все три зародышевых листка при имплантации в бластоцист или использовании в тератоме образования.
Раннее развитие линий iPS-клеток не было эффективным, поскольку они давали до 5% соматических клеток, успешно перепрограммированных в состояние, подобное стволовым клеткам. При использовании иммортализованных соматических клеток (дифференцированных клеток с усиленной регуляцией hTERT ) репрограммирование iPS-клеток было увеличено в двадцать раз по сравнению с перепрограммированием с использованием смертные клетки.
Реактивация hTERT, а затем теломеразы в человеческих iPS-клетках использовалась как индикатор плюрипотентности и перепрограммирования в Состояние, подобное клеткам ES (эмбриональные стволовые) при использовании смертных клеток. Перепрограммированные клетки, которые не экспрессируют достаточные уровни hTERT, переходят в состояние покоя после ряда повторений в зависимости от длины теломер, сохраняя при этом способность дифференцироваться, подобную стволовым клеткам. Реактивация активности TERT может быть достигнута с использованием только трех из четырех факторов репрограммирования, описанных Такахаши и Яманака: а именно: Oct3 / 4, Sox2 и Klf4 необходимы, а c-Myc - нет. Однако это исследование было выполнено с клетками, содержащими эндогенные уровни c-Myc, которых могло быть достаточно для репрограммирования.
Длина теломер в здоровых взрослых клетках удлиняется и приобретает эпигенетические характеристики, аналогичные характеристикам ES-клеток, когда они перепрограммированы как iPS-клетки. Некоторые эпигенетические характеристики ES-клеток включают низкую плотность триметилированных гистонов H3K9 и H4K20 на теломерах, а также повышенное детектируемое количество транскриптов TERT и активность белка. Без восстановления TERT и связанных с ним теломеразных белков эффективность iPS-клеток резко снизилась бы. iPS-клетки также теряют способность к самообновлению и в конечном итоге стареют.
DKC (врожденный дискератоз ). Все пациенты характеризуются неправильным поддержанием теломер, что приводит к проблемы с регенерацией стволовых клеток. Клетки iPS, полученные от DKC пациентов с гетерозиготной мутацией в гене TERT, демонстрируют 50% снижение активности теломеразы по сравнению с диким типом iPS-клетки. Напротив, мутации в гене TERC (часть РНК комплекса теломеразы) могут быть преодолены посредством повышающей регуляции из-за репрограммирования, пока ген hTERT не поврежден и функционирует. Наконец, iPS-клетки, созданные с использованием клеток DKC с мутантным геном дискерина (DKC1), не могут собрать комплекс hTERT / РНК и, следовательно, не имеют функциональной теломеразы.
Функциональность и эффективность перепрограммированной iPS-клетки определяется способностью клетки повторно активировать теломеразный комплекс и удлинять свои теломеры, обеспечивая самообновление. hTERT является основным ограничивающим компонентом комплекса теломеразы, а дефицит интактного hTERT препятствует активности теломеразы, что делает iPS-клетки неподходящим путем для лечения теломер-дефицитных расстройств.
Хотя механизм до конца не изучен, воздействие на TERT-дефицитные гемопоэтические клетки андрогенами привело к повышению уровня активности TERT. Клетки с гетерозиготной мутацией TERT, как у пациентов с DKC (врожденный дискератоз), которые обычно демонстрируют низкие исходные уровни TERT, можно было восстановить до нормальных уровней, сравнимых с контрольными клетками. Уровни мРНК TERT также увеличиваются при воздействии андрогенов. Андрогенная терапия может стать подходящим методом лечения заболеваний системы кровообращения, таких как дегенерация костного мозга и низкий показатель крови, связанный с DKC и другими состояниями с дефицитом теломеразы.
По мере старения организмов и размножения клеток теломеры укорачиваются с каждым раундом репликации. Клетки, ограниченные определенной линией, способны делиться только заданное количество раз, заданное длиной теломер, прежде чем они стареют. Истощение и раскрытие теломер было связано с дегенерацией органов, недостаточностью и фиброзом из-за того, что предки стали неподвижными и неспособными дифференцироваться. Используя in vivo TERT-дефицитную модель мыши, реактивация гена TERT в покоящихся популяциях во многих органах реактивировала теломеразу и восстанавливала способности клеток к дифференцировать. Реактивация TERT подавляет сигналы повреждения ДНК, связанные с клеточными митотическими контрольными точками, обеспечивая пролиферацию и устранение дегенеративного фенотипа. В другом исследовании введение гена TERT здоровым годовалым мышам с использованием сконструированного аденоассоциированного вируса привело к увеличению продолжительности жизни на 24% без какого-либо увеличения заболеваемости раком.
Парадоксально, но генетические варианты в локусе TERT, которые связаны с большей длиной теломер лейкоцитов, связаны с более быстрыми темпами эпигенетического старения в крови в соответствии с молекулярным биомаркером старения, известным как эпигенетический часы. Точно так же экспрессия человеческого TERT не останавливает эпигенетическое старение в человеческих фибробластах.
Ген hTERT стал основным направлением генной терапии, связанной с раком, из-за его экспрессия в опухолевых клетках, но не в соматических взрослых клетках. Один из методов заключается в предотвращении трансляции мРНК hTERT посредством введения миРНК, которые представляют собой комплементарные последовательности, которые связываются с мРНК, предотвращая процессинг пост-гена транскрипция. Этот метод не устраняет полностью активность теломеразы, но снижает активность теломеразы и уровни мРНК hTERT, наблюдаемые в цитоплазме. Более высокие показатели успеха наблюдались in vitro при сочетании использования антисмысловых последовательностей hTERT с введением подавляющей опухоль плазмиды инфекцией аденовирусом, такой как PTEN.
Другой метод было изучено манипулирование промотором hTERT для индукции апоптоза в опухолевых клетках. Последовательности плазмидной ДНК могут быть получены с использованием промотора hTERT, за которым следуют гены, кодирующие определенные белки. Белок может быть токсином, фактором апоптоза или вирусным белком. Токсины, такие как токсин дифтерии, мешают клеточным процессам и в конечном итоге вызывают апоптоз. Факторы апоптозной смерти, такие как FADD (Fas-ассоциированный белок с доменом смерти), можно использовать, чтобы заставить клетки, экспрессирующие hTERT, претерпеть апоптоз. Вирусные белки, такие как вирусная тимидинкиназа, могут использоваться для специфического нацеливания лекарственного средства. Путем введения пролекарства, активируемого только вирусным ферментом, можно достичь специфического воздействия на клетки, экспрессирующие hTERT. При использовании промотора hTERT будут затронуты только клетки, экспрессирующие hTERT, и это дает возможность специфического воздействия на опухолевые клетки.
Помимо лечения рака, ген hTERT использовался для стимулирования роста волосяных фолликулов. Схематическая анимация генной терапии показана ниже.
Было показано, что обратная транскриптаза теломеразы взаимодействует с:
