Протеомика дробовика относится к использованию восходящей протеомики для идентификации белков. в сложных смесях с использованием комбинации высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией. Название происходит от секвенирования из дробовика ДНК, которое само названо в честь быстро расширяющейся, квази-случайной схемы стрельбы дробовика. Наиболее распространенный метод «дробовика» протеомики начинается с того, что белки в смеси расщепляются, и полученные пептиды разделяются с помощью жидкостной хроматографии. Тандемная масс-спектрометрия затем используется для идентификации пептидов.
Нацеленная протеомика с использованием SRM и методов сбора данных, не зависящих от данных, часто рассматривается как альтернатива дробовой протеомике в области восходящей протеомики. В то время как протеомика дробовика использует зависимый от данных выбор ионов-предшественников для генерации сканирования ионов фрагментов, вышеупомянутые методы используют детерминированный метод для получения сканирований ионов фрагментов.
Протеомика дробовика возникла из-за трудностей использования предыдущих технологий для разделения сложных смесей. В 1975 году О’Фаррелл и Клозе описали двумерный электрофорез в полиакриламидном геле (2D-PAGE ) с возможностью разделения сложных белковых смесей. Развитие технологии лазерной десорбционной ионизации с использованием матрицы (MALDI ), ионизации электрораспылением (ESI ) и поиска в базах данных продолжало расширять область протеомики. Однако эти методы все еще затрудняли идентификацию и разделение белков с низким содержанием, аберрантных белков и мембранных белков. Протеомика дробовика возникла как метод, который может разрешить даже эти белки.
Протеомика дробовика позволяет глобальную идентификацию белков, а также возможность систематически профилировать динамические протеомы. Это также позволяет избежать умеренной эффективности разделения и низкой масс-спектральной чувствительности, связанной с анализом интактного белка.
Динамическая фильтрация исключения, которая часто используется в протеомике дробовика, максимизирует количество идентифицированных белков в за счет случайной выборки. Эта проблема может усугубляться недостаточной выборкой, свойственной протеомике дробовика.
ВЭЖХ Agilent 1200 Квадрупольный времяпролетный тандемный масс-спектрометр (Q-TOF)Клетки, содержащие белок желаемое дополнение выращивают. Затем белки экстрагируются из смеси и расщепляются протеазой для получения смеси пептидов. Затем смесь пептидов загружают непосредственно в микрокапиллярную колонку, и пептиды разделяют по гидрофобности и заряду. По мере того, как пептиды элюируются из колонки, они ионизируются и разделяются по m / z на первой стадии тандемной масс-спектрометрии. Выбранные ионы подвергаются диссоциации, вызванной столкновением, или другому процессу, вызывающему фрагментацию. Заряженные фрагменты разделяются на втором этапе тандемной масс-спектрометрии.
«Отпечаток пальца» масс-спектра фрагментации каждого пептида используется для идентификации белка, из которого они получены, путем поиска в базе данных последовательностей с помощью коммерчески доступного программного обеспечения (например, SEQUEST или MASCOT ). Примерами баз данных последовательностей являются база данных Genpept или база данных PIR. После поиска в базе данных каждое совпадение пептидного спектра (PSM) необходимо оценить на предмет достоверности. Этот анализ позволяет исследователям профилировать различные биологические системы.
Вырожденные пептиды (общие для двух или более белков в базе данных) могут затруднить идентификацию белка для которым они принадлежат. Кроме того, некоторые образцы протеома позвоночных имеют большое количество паралогов. Наконец, альтернативный сплайсинг у высших эукариот может привести к множеству идентичных подпоследовательностей белков.
После секвенирования генома человека следующим шагом является проверка и функциональная аннотация всех предсказанных генов и их белковые продукты. Протеомика дробовика может быть использована для функциональной классификации или сравнительного анализа этих белковых продуктов. Его можно использовать в проектах, начиная от крупномасштабного целого протеома до сосредоточения внимания на одном семействе белков. Это может быть сделано в исследовательских лабораториях или коммерчески.
Одним из примеров этого является исследование Washburn, Wolters, Yates, в котором они использовали протеомику дробовика на протеоме штамма Saccharomyces cerevisiae. вырос до середины логарифмической фазы. Они смогли обнаружить и идентифицировать 1484 белка, а также идентифицировать белки, которые редко встречаются при протеомном анализе, включая белки с низким содержанием, такие как факторы транскрипции и протеинкиназы. Они также смогли идентифицировать 131 белок с тремя или более предсказанными трансмембранными доменами.
Vaisar et al. использует протеомику дробовика, чтобы вовлечь ингибирование протеазы и активацию комплемента в противовоспалительные свойства липопротеина высокой плотности. В исследовании Lee et al., Более высокий уровень экспрессии hnRNP A2 / B1 и Hsp90 наблюдался в клетках гепатомы человека HepG2, чем в клетках дикого типа. Это привело к поиску сообщений о функциональных ролях, которые опосредуются обоими этими многофункциональными клеточными шаперонами.