Войти
| Рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза оксигеназа | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Трехмерное изображение активированного RuBisCO из шпината в открытой форме с доступным активным сайтом. Остатки Lys175 в активном центре отмечены розовым цветом, а крупный план остатка показан справа для одного из мономеров, составляющих фермент. | |||||||||
| Идентификаторы | |||||||||
| ЕС нет. | 4.1.1.39 | ||||||||
| № CAS | 9027-23-0 | ||||||||
| Базы данных | |||||||||
| IntEnz | Просмотр IntEnz | ||||||||
| BRENDA | BRENDA запись | ||||||||
| ExPASy | Просмотр NiceZyme | ||||||||
| КЕГГ | Запись в KEGG | ||||||||
| MetaCyc | метаболический путь | ||||||||
| ПРИАМ | профиль | ||||||||
| Структуры PDB | RCSB PDB PDBe PDBsum | ||||||||
| Генная онтология | Amigo / QuickGO | ||||||||
| |||||||||
Рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза-оксигеназа, широко известная под аббревиатурами RuBisCo, rubisco, RuBPCase или RuBPco, представляет собой фермент, участвующий в первой основной стадии фиксации углерода, процесса, в котором атмосферный углекислый газ превращается в растения и другие фотосинтезирующие организмы к богатым энергией молекулам, таким как глюкоза. С химической точки зрения, это катализирует в карбоксилирования из рибулозо-1,5-бисфосфата (также известный как RuBP). Вероятно, это самый распространенный фермент на Земле.
RuBisCO важен с биологической точки зрения, поскольку он катализирует первичную химическую реакцию, посредством которой неорганический углерод попадает в биосферу. Хотя многие автотрофные бактерии и археи фиксируют углерод посредством восстановительного пути ацетил-КоА, 3-гидроксипропионатного цикла или обратного цикла Кребса, эти пути вносят относительно небольшой вклад в глобальную фиксацию углерода по сравнению с тем, что катализируется RuBisCO. Фосфоенолпируваткарбоксилаза, в отличие от RuBisCO, только временно фиксирует углерод. Отражая его важность, RuBisCO является наиболее распространенным белком в листьях, на его долю приходится 50% растворимого белка листа у растений C 3 (20–30% общего азота листа) и 30% растворимого белка листа у растений C 4 (5–9 % от общего азота листьев). Учитывая его важную роль в биосфере, генная инженерия RuBisCO в сельскохозяйственных культурах вызывает постоянный интерес (см. Ниже).
Активный центр RuBisCO Galdieria sulphuraria с CO 2: Остатки, участвующие как в активном центре, так и в стабилизации CO 2 для ферментативного катализа, показаны цветом и помечены. Расстояния взаимодействий водородных связей показаны в ангстремах. Ион Mg 2+ (зеленая сфера) показан координированным с CO 2, за ним следуют три молекулы воды (красные сферы). Все остальные остатки отображаются в оттенках серого. 
Расположение RbCl гена в геноме хлоропласта из Резуховидка Таль (позиция приблизительно до 55-56.4 кб). rbcL - один из 21 гена, кодирующего белок, участвующего в фотосинтезе (зеленые прямоугольники). У растений, водорослей, цианобактерий, фототрофных и хемоавтотрофных протеобактерий фермент обычно состоит из двух типов белковых субъединиц, называемых большой цепью ( L, около 55000 Да ) и малой цепочкой ( S, около 13000 Да). Ген большой цепи ( rbcL) кодируется ДНК хлоропластов растений. Обычно в ядре растительных клеток имеется несколько родственных генов с малой цепью, и эти небольшие цепи импортируются в стромальный компартмент хлоропластов из цитозоля, пересекая внешнюю мембрану хлоропласта. Сайты связывания ферментативно активного субстрата ( рибулозо- 1,5-бисфосфата) расположены в больших цепях, которые образуют димеры, в которых аминокислоты из каждой большой цепи вносят вклад в сайты связывания. В общей сложности восемь больших цепей (= 4 димера) и восемь малых цепей собираются в более крупный комплекс размером около 540 000 Да. У некоторых протеобактерий и динофлагеллят обнаружены ферменты, состоящие только из крупных субъединиц.
Ионы магния ( Mg2+ ) необходимы для ферментативной активности. Правильное расположение Mg2+ в активном центре фермента включает добавление «активирующей» молекулы углекислого газа ( CO 2 ) к лизину в активном центре (образуя карбамат ). Mg 2+ действует путем депротонирования остатка Lys210, заставляя остаток Lys поворачиваться на 120 градусов к транс- конформеру, уменьшая расстояние между азотом Lys и углеродом CO. 2. Непосредственная близость позволяет образовывать ковалентную связь, в результате чего образуется карбамат. Mg 2+ сначала получает возможность связываться с активным сайтом путем поворота His335 в альтернативную конформацию. Mg 2+ затем координируются Его остатками активного центра (His300, His302, His335), и частично нейтрализованный путем координации трех молекул воды и их конверсии в - ОН. Эта координация приводит к нестабильному комплексу, но создает благоприятную среду для связывания Mg 2+. Образованию карбамата способствует щелочной pH. Уровень pH и концентрация ионов магния в жидкой среде (у растений - в строме хлоропласта ) повышаются на свету. Роль изменения pH и уровней ионов магния в регуляции активности фермента RuBisCO обсуждается ниже. После образования карбамата His335 завершает активацию, возвращаясь в свое исходное положение за счет тепловых колебаний.
Две основные реакции RuBisCo: фиксация CO 2 и оксигенация. RuBisCO - один из многих ферментов цикла Кальвина. Когда Рубиско способствует атаке CO 2 на углерод C 2 RuBP и последующему разрыву связи между углеродом C 3 и C 2, образуются 2 молекулы глицерат-3-фосфата. Преобразование включает следующие стадии: енолизацию, карбоксилирование, гидратацию, разрыв связи CC и протонирование.
Субстратами для RuBisCO являются рибулозо-1,5-бисфосфат и диоксид углерода (в отличие от «активирующего» диоксида углерода). RuBisCO также катализирует реакцию рибулозо-1,5-бисфосфата и молекулярного кислорода ( O 2) вместо диоксида углерода ( CO 2). Различие между CO 2 и O 2 подложек объясняется различным взаимодействием квадрупольных моментов подложки и высоким градиентом электростатического поля. Этот градиент устанавливается димерной формой минимально активного RuBisCO, который своими двумя компонентами обеспечивает комбинацию противоположно заряженных доменов, необходимых для взаимодействия фермента с O 2 и CO. 2. Эти условия помогают объяснить низкую скорость оборота, обнаруженную в RuBisCO: для увеличения напряженности электрического поля, необходимого для достаточного взаимодействия с квадрупольными моментами субстратов, C- и N-концевые сегменты фермента должны быть закрыты, что позволяет активный центр необходимо изолировать от растворителя и понизить диэлектрическую проницаемость. Эта изоляция имеет значительную энтропийную стоимость и приводит к низкой текучести кадров.
Карбамилирование ε-аминогруппы Lys201 стабилизируется за счет координации с Mg 2+. Эта реакция включает связывание карбоксилатных концов Asp203 и Glu204 с ионом Mg 2+. Субстрат RuBP связывает Mg 2+, вытесняя два из трех акволигандов.
Энолизация RuBP - это превращение кето-таутомера RuBP в ендиол (ат). Энолизация инициируется депротонированием на C3. Основание фермента на этой стадии обсуждалось, но стерические ограничения, наблюдаемые в кристаллических структурах, сделали Lys201 наиболее вероятным кандидатом. В частности, кислород карбамата на Lys201, который не скоординирован с ионом Mg, депротонирует углерод C3 RuBP с образованием 2,3-ендиолата.
Трехмерное изображение активного центра шпината RuBisCO в комплексе с ингибитором 2-карбоксиарабинитол-1,5-бисфосфатом, CO 2 и Mg 2+. (PDB: 1IR1; Ligand View [CAP] 501: A) Карбоксилирование 2,3-ендиолата приводит к промежуточному 3-кето-2'-карбоксиарабинитол-1,5-бисфосфату, и Lys334 позиционируется для облегчения добавления субстрата CO 2, поскольку он заменяет третью координированную воду Mg 2+. молекулу и добавляют непосредственно к эндиолу. Никакого комплекса Михаэлиса в этом процессе не образуется. Гидратация этого кетона приводит к дополнительной гидроксигруппе на C3, образуя промежуточный гем-диол. Карбоксилирование и гидратация были предложены либо как одна согласованная стадия, либо как две последовательные стадии. Согласованный механизм подтверждается близостью молекулы воды к C3 RuBP в нескольких кристаллических структурах. В структуре шпината другие остатки хорошо расположены для помощи на стадии гидратации, поскольку они находятся в пределах расстояния водородных связей молекулы воды.
Промежуточный гем-диол расщепляется по связи C2-C3 с образованием одной молекулы глицерат-3-фосфата и отрицательно заряженного карбоксилата. Стереоспецифическое протонирование C2 этого карбаниона приводит к другой молекуле глицерат-3-фосфата. Считается, что этому этапу способствует Lys175 или, возможно, карбамилированный Lys201.
Когда диоксид углерода является субстратом, продукт карбоксилазной реакции представляет собой нестабильный шестиуглеродный фосфорилированный промежуточный продукт, известный как 3-кето-2-карбоксиарабинитол-1,5-бисфосфат, который быстро распадается на две молекулы глицерат-3-фосфата. 3-фосфоглицерат можно использовать для производства более крупных молекул, таких как глюкоза.
Побочные действия Rubisco могут привести к бесполезным или тормозящим побочным продуктам; одним из таких продуктов является ксилулозо-1,5-бисфосфат, который ингибирует активность Rubisco.
Когда молекулярный кислород является субстратом, продуктами оксигеназной реакции являются фосфогликолят и 3-фосфоглицерат. Фосфогликолят рециркулирует посредством последовательности реакций, называемых фотодыханием, в которых участвуют ферменты и цитохромы, расположенные в митохондриях и пероксисомах (это случай восстановления метаболитов ). В этом процессе две молекулы фосфогликолата превращаются в одну молекулу диоксида углерода и одну молекулу 3-фосфоглицерата, которые могут повторно войти в цикл Кальвина. Часть фосфогликолата, поступающего по этому пути, может удерживаться растениями для производства других молекул, таких как глицин. При нормальных уровнях содержания углекислого газа и кислорода соотношение реакций составляет примерно 4: 1, что приводит к чистому связыванию углекислого газа только 3,5. Таким образом, неспособность фермента предотвращать реакцию с кислородом значительно снижает фотосинтетическую способность многих растений. Некоторые растения, многие водоросли и фотосинтезирующие бактерии преодолели это ограничение, разработав средства для увеличения концентрации углекислого газа вокруг фермента, включая фиксацию углерода C 4, метаболизм крассулоидной кислоты и использование пиреноидов.
Обзор цикла Кальвина и фиксации углерода. Некоторые ферменты могут проводить тысячи химических реакций каждую секунду. Однако RuBisCO медленный, фиксируя только 3-10 молекул углекислого газа каждую секунду на молекулу фермента. Таким образом, реакция, катализируемая RuBisCO, является основным фактором, ограничивающим скорость цикла Кальвина в течение дня. Тем не менее, в большинстве условий и когда свет не ограничивает фотосинтез иным образом, скорость RuBisCO положительно реагирует на увеличение концентрации углекислого газа.
RuBisCO обычно активен только в течение дня, так как рибулозо-1,5-бисфосфат не регенерируется в темноте. Это связано с регуляцией нескольких других ферментов цикла Кальвина. Кроме того, активность RuBisCO координируется с активностью других ферментов цикла Кальвина несколькими другими способами:
При освещении хлоропластов, то рН в строме возрастает от 7,0 до 8,0 из протонов (ионов водорода, H+ ) градиент, создаваемый через тилакоидную мембрану. Перемещение протонов в тилакоиды осуществляется под действием света и является фундаментальным для синтеза АТФ в хлоропластах (Дополнительная литература: Центр фотосинтетических реакций ; Светозависимые реакции ). Чтобы сбалансировать ионный потенциал через мембрану, ионы магния ( Mg2+ ) выходят из тилакоидов в ответ, увеличивая концентрацию магния в строме хлоропластов. RuBisCO имеет высокий оптимальный pH (может бытьgt; 9,0, в зависимости от концентрации иона магния) и, таким образом, становится «активированным» при введении диоксида углерода и магния в активные центры, как описано выше.
У растений и некоторых водорослей для быстрого образования критического карбамата в активном центре RuBisCO требуется другой фермент, активаза RuBisCO (Rca, GO: 0046863, P10896 ). Это необходимо, потому что рибулозо-1,5-бисфосфат (RuBP) сильнее связывается с активными центрами RuBisCO, когда присутствует избыток карбамата, предотвращая развитие процессов. В свете этого, активаза RuBisCO способствует высвобождению ингибирующего (или - с некоторых точек зрения - запасающего) RuBP из каталитических центров RuBisCO. Активаза также необходима для некоторых растений (например, табака и многих бобов), потому что в темноте RuBisCO ингибируется (или защищается от гидролиза) конкурентным ингибитором, синтезируемым этими растениями, аналогом субстрата 2-карбокси-D-арабитинол 1- фосфат (CA1P). CA1P прочно связывается с активным центром карбамилированного RuBisCO и в еще большей степени подавляет каталитическую активность. CA1P также поддерживает RuBisCO в конформации, защищенной от протеолиза. На свету, активаза RuBisCO также способствует высвобождению CA1P из каталитических центров. После того, как CA1P высвобождается из RuBisCO, он быстро превращается в неингибирующую форму под действием активируемой светом CA1P-фосфатазы. Даже без этих сильных ингибиторов один раз в несколько сотен реакций нормальные реакции с углекислым газом или кислородом не завершаются; другие ингибиторные аналоги субстрата все еще образуются в активном центре. И снова активаза RuBisCO может способствовать высвобождению этих аналогов из каталитических центров и поддерживать фермент в каталитически активной форме. Однако при высоких температурах RuBisCO активирует агрегацию и больше не может активировать RuBisCO. Это способствует снижению карбоксилирующей способности, наблюдаемой при тепловом стрессе.
Удаление ингибирующего RuBP, CA1P и других аналогов ингибирующего субстрата с помощью активазы требует потребления АТФ. Эта реакция ингибируется присутствием АДФ, и, таким образом, активность активазы зависит от соотношения этих соединений в строме хлоропласта. Кроме того, у большинства растений чувствительность активазы к соотношению АТФ / АДФ модифицируется за счет состояния восстановления / окисления ( окислительно-восстановительного ) стромы через другой небольшой регуляторный белок, тиоредоксин. Таким образом, активность активазы и состояние активации RuBisCO можно регулировать в зависимости от интенсивности света и, таким образом, скорости образования субстрата рибулозо-1,5-бисфосфат.
У цианобактерий неорганический фосфат (P i) также участвует в скоординированной регуляции фотосинтеза: P i связывается с активным сайтом RuBisCO и с другим сайтом большой цепи, где он может влиять на переходы между активированной и менее активной конформациями фермента.. Таким образом, активация бактериального RuBisCO может быть особенно чувствительной к уровням P i, что может заставить его действовать аналогично тому, как действует активаза RuBisCO у высших растений.
Поскольку углекислый газ и кислород конкурируют в активном центре RuBisCO, фиксация углерода посредством RuBisCO может быть усилена путем увеличения уровня углекислого газа в компартменте, содержащем RuBisCO ( строма хлоропласта ). Несколько раз в процессе эволюции растений возникали механизмы повышения уровня углекислого газа в строме (см. Фиксация углерода C 4 ). Использование кислорода в качестве субстрата кажется загадочным процессом, поскольку он, кажется, выбрасывает захваченную энергию. Однако это может быть механизм предотвращения перегрузки углеводами в периоды сильного светового потока. Эта слабость фермента является причиной фотодыхания, так что здоровые листья при ярком свете могут иметь нулевую чистую фиксацию углерода, когда соотношение O 2в CO 2доступный для RuBisCO смещается слишком далеко в сторону кислорода. Это явление в первую очередь зависит от температуры: высокие температуры могут снизить концентрацию CO. 2растворяется во влаге тканей листа. Это явление также связано с водным стрессом : поскольку листья растений охлаждаются испарением, недостаток воды приводит к высокой температуре листьев. Растения C 4 изначально используют фермент PEP карбоксилазу, который имеет более высокое сродство к CO. 2. В процессе сначала образуется 4-углеродное промежуточное соединение, которое перемещается в место фотосинтеза C 3, а затем декарбоксилируется, высвобождая CO. 2для повышения концентрации CO 2, отсюда и название растения C 4.
Растения с метаболизмом крассулоидной кислоты (CAM) держат свои устьица закрытыми в течение дня, что позволяет экономить воду, но предотвращает светонезависимые реакции (также известные как цикл Кальвина ), поскольку для этих реакций требуется углекислый газ. 2проходить через эти отверстия путем газообмена. Испарение через верхнюю часть листа предотвращается слоем воска.
Поскольку RuBisCO часто ограничивает скорость фотосинтеза у растений, можно повысить эффективность фотосинтеза, изменив гены RuBisCO в растениях для повышения каталитической активности и / или снижения скорости оксигенации. Это может улучшить биосеквестрации из CO 2и быть одновременно важной стратегией в области изменения климата и стратегией повышения урожайности сельскохозяйственных культур. Исследуемые подходы включают перенос генов RuBisCO из одного организма в другой, создание активазы Rubisco из термофильных цианобактерий в чувствительных к температуре растений, повышение уровня экспрессии субъединиц RuBisCO, экспрессию малых цепей RuBisCO из хлоропластной ДНК и изменение генов RuBisCO для повышения специфичности для углекислого газа или иным образом увеличивают скорость связывания углерода.
В целом сайт-направленный мутагенез RuBisCO был в основном безуспешным, хотя мутированные формы белка были получены в растениях табака с субъединицей C 4, а RuBisCO с более C 4 -подобными кинетическими характеристиками были получены в рисе с помощью ядерных трансформация. Было показано, что надежная и надежная инженерия для получения RuBisCO и других ферментов в цикле C 3 возможна, и это было впервые достигнуто в 2019 году с помощью подхода синтетической биологии.
Один из способов - ввести в растения варианты RuBisCO с естественно высокими значениями специфичности, например, из красной водоросли Galdieria partita. Это может улучшить фотосинтетическую эффективность сельскохозяйственных культур, хотя возможные негативные воздействия еще предстоит изучить. Достижения в этой области включают замену фермента табака ферментом пурпурной фотосинтетической бактерии Rhodospirillum rubrum. В 2014 году две транспластомные линии табака с функциональным RuBisCO из цианобактерии Synechococcus elongatus PCC7942 (Se7942) были созданы путем замены RuBisCO генами большой и малой субъединиц фермента Se7942 в комбинации либо с соответствующим шапероном сборки Se7942, RbcX, либо внутренний карбоксисомный белок CcmM35. Оба мутанта имели повышенный уровень CO. 2скорость фиксации при измерении в молекулах углерода на RuBisCO. Однако мутантные растения росли медленнее, чем растения дикого типа.
Недавняя теория исследует компромисс между относительной специфичностью (т. Е. Способностью отдавать предпочтение CO 2фиксация на O 2включение, которое приводит к энергоемким процессам фотодыхания ) и скорости, с которой образуется продукт. Авторы приходят к выводу, что RuBisCO, возможно, действительно эволюционировал, чтобы достичь точки «почти идеального» у многих растений (с широко варьирующейся доступностью субстрата и условиями окружающей среды), достигнув компромисса между специфичностью и скоростью реакции. Было также высказано предположение, что оксигеназная реакция RuBisCO предотвращает истощение CO 2 вблизи его активных центров и обеспечивает поддержание окислительно-восстановительного состояния хлоропластов.
Поскольку фотосинтез является единственным наиболее эффективным естественным регулятором углекислого газа в атмосфере Земли, биохимическая модель реакции RuBisCO используется в качестве основного модуля моделей изменения климата. Таким образом, правильная модель этой реакции необходима для базового понимания взаимосвязей и взаимодействий моделей окружающей среды.
В настоящее время существует очень мало эффективных методов экспрессии функционального растения Rubisco в бактериальных хозяевах для исследований генетических манипуляций. Это во многом связано с потребностью Рубиско в сложных клеточных механизмах для его биогенеза и поддержания метаболизма, включая кодируемые ядром субъединицы RbcS, которые обычно импортируются в хлоропласты в виде развернутых белков. Кроме того, серьезными проблемами также являются достаточная экспрессия и взаимодействие с активазой Rubisco. Один успешный метод экспрессии Rubisco в E. coli включает совместную экспрессию нескольких шаперонов хлоропластов, хотя это было показано только для Arabidopsis thaliana Rubisco.
Из-за его высокого содержания в растениях (обычно 40% от общего содержания белка), RuBisCO часто препятствует анализу важных сигнальных белков, таких как факторы транскрипции, киназы и регуляторные белки, обнаруженных в меньшем количестве (10-100 молекул на клетку) в растениях.. Например, использование масс-спектрометрии смесей растительных белков может привести к множественным интенсивным пикам субъединиц RuBisCO, которые мешают и скрывают пики других белков.
В последнее время один из эффективных методов осаждения RuBisCO включает использование раствора сульфата протамина. Другие существующие методы истощения RuBisCO и изучения белков с более низким содержанием включают методы фракционирования с кальцием и фитатом, гель-электрофорез с полиэтиленгликолем, аффинную хроматографию и агрегацию с использованием DTT, хотя эти методы более трудоемки и менее эффективны по сравнению с осаждением сульфата протамина..
Ген хлоропласта rbc L, который кодирует большую субъединицу RuBisCO, широко используется в качестве подходящего локуса для анализа филогенетики в систематике растений.
С эволюцией пути C 4 -фиксации у некоторых видов растений, C 3 RuBisCO эволюционировал, чтобы иметь более быстрый оборот CO 2в обмен на более низкую специфичность в результате большей локализации CO 2из клеток мезофилла в пачке клеток оболочки. Это было достигнуто за счет повышения конформационной гибкости перехода «открыто-закрыто» в цикле Кальвина. Лабораторные филогенетические исследования показали, что эта эволюция сдерживалась компромиссом между стабильностью и активностью, вызванным серией необходимых мутаций для C 4 RuBisCO. Более того, для поддержания дестабилизирующих мутаций эволюции до C 4 RuBisCO предшествовал период, в течение которого мутации обеспечивали повышенную стабильность фермента, создавая буфер для поддержания и поддержания мутаций, необходимых для C 4 RuBisCO. Было обнаружено, что для помощи в этом процессе буферизации новый фермент развил серию стабилизирующих мутаций. Хотя RuBisCO всегда накапливал новые мутации, большинство из этих мутаций, которые выжили, не оказали значительного влияния на стабильность белка. Дестабилизирующие мутации C 4 на RuBisCO поддерживаются давлением окружающей среды, таким как низкий уровень CO 2 концентрации, требующие принесения в жертву стабильности ради новых адаптивных функций.
Термин «RuBisCO» был придуман с юмором в 1979 году Дэвидом Айзенбергом на семинаре в честь выхода на пенсию одного из первых, выдающихся исследователей RuBisCO Сэма Уайлдмана, а также отсылки к торговому названию закусок « Nabisco » в связи с попытками Уайлдмана создать пищевая протеиновая добавка из листьев табака.
Использование заглавных букв в названии давно обсуждается. Это может быть заглавные для каждой буквы полного имени ( R И.Б. U проигрывает 1,5- бис фосфат с arboxylase / о xygenase), но он также утверждал, что все должно быть в нижнем регистре (RuBisCO), как и другие такие термины, как подводное плавание или лазер.
|
Рисунок 3. На этом рисунке каждой белковой цепи в комплексе (LS) 2 присвоен свой цвет для облегчения идентификации. 