Войти
Хроматография с обращенной фазой (также называемая RPC, обращенно-фазовая хроматография или гидрофобная хроматография ) включает любой хроматографический метод, в котором используется гидрофобная стационарная фаза. RPC относится к жидкостной (а не газовой) хроматографии.
В 1970-х годах большая часть жидкостной хроматографии выполнялась с использованием неподвижной фазы на твердом носителе (также называемой колонкой), содержащей немодифицированные кремнеземные или глиноземистые смолы. Этот тип техники теперь называется нормально-фазовой хроматографией. Поскольку в этом методе неподвижная фаза является гидрофильной, молекулы с гидрофильными свойствами, содержащиеся в подвижной фазе, будут иметь высокое сродство к неподвижной фазе и, следовательно, будут адсорбироваться на насадке колонки. Гидрофобные молекулы обладают меньшим сродством к насадке колонки и будут проходить через нее, чтобы элюироваться и обнаруживаться первыми. Элюирование гидрофильных молекул, адсорбированных на насадке колонки, требует использования более гидрофильных или более полярных растворителей в подвижной фазе, чтобы сместить распределение частиц в неподвижной фазе в сторону распределения частиц в подвижной фазе.
Хроматография с обращенной фазой - это метод, в котором алкильные цепи ковалентно связаны с частицами неподвижной фазы для создания гидрофобной неподвижной фазы, которая имеет более сильное сродство к гидрофобным или менее полярным соединениям. Использование гидрофобной неподвижной фазы по существу является противоположностью хроматографии с нормальной фазой, поскольку полярность подвижной и неподвижной фаз поменялась местами - отсюда и термин обращенно-фазовая хроматография. В обращенно-фазовой хроматографии используется полярная ( водная ) подвижная фаза. В результате гидрофобные молекулы в полярной подвижной фазе имеют тенденцию адсорбироваться на гидрофобной неподвижной фазе, а гидрофильные молекулы в подвижной фазе проходят через колонку и элюируются первыми. Гидрофобные молекулы могут быть элюированы из колонки путем уменьшения полярности подвижной фазы с использованием органического (неполярного) растворителя, который снижает гидрофобные взаимодействия. Чем более гидрофобна молекула, тем сильнее она будет связываться с неподвижной фазой и тем более высокая концентрация органического растворителя потребуется для элюирования молекулы.
Многие математические и экспериментальные соображения, используемые в других хроматографических методах, также применимы к RPC (например, разрешение разделения зависит от длины колонки). Его можно использовать для разделения самых разных молекул. Обычно он не используется для разделения белков, потому что органические растворители, используемые в RPC, могут денатурировать многие белки. По этой причине для разделения белков чаще используется нормально-фазовая хроматография. Однако денатурация белков может быть полезной при более позднем анализе образцов, полученных с помощью хроматографии. Если на анализируемых белках проводится ферментативное расщепление трипсином, для этого больше подходит линеаризованный белок. Следовательно, денатурация белков с использованием подходящих растворителей, которые вызывают разворачивание белков, на самом деле может быть преднамеренной перед взятием фракционированного образца с помощью масс-спектрометрии.
Сегодня RPC - это часто используемый аналитический метод. Существует множество стационарных фаз, доступных для использования в RPC, что обеспечивает большую гибкость при разработке методов разделения.
Любое инертное полярное вещество, которое обеспечивает достаточную упаковку, можно использовать для обращенно-фазовой хроматографии. Самая популярная колонка представляет собой диоксид кремния, связанный с октадецильной углеродной цепью (C18) (классификация USP L1). Далее следуют диоксид кремния, связанный с C8 (L7), чистый диоксид кремния (L3), диоксид кремния с циано-связью (L10) и диоксид кремния с фенильной связью (L11). Обратите внимание, что C18, C8 и фенил являются специальными смолами с обращенной фазой, в то время как цианоколонки могут использоваться в режиме с обращенной фазой в зависимости от аналита и условий подвижной фазы. Не все колонки C18 обладают одинаковыми удерживающими свойствами. Функционализацию поверхности диоксида кремния можно проводить в мономерной или полимерной реакции с различными короткоцепочечными органосиланами, используемыми на второй стадии для покрытия оставшихся силанольных групп (блокирование концов ). Хотя общий механизм удерживания остается неизменным, небольшие различия в химическом составе поверхности различных неподвижных фаз приведут к изменениям в селективности.
Современные колонны имеют разную полярность. ПФП - пентафторфенил. CN - циано. NH2 - амино. ODS - октадецил или C18. ODCN представляет собой колонку смешанного режима, состоящую из C18 и нитрила. SCX - это сильный катионный обмен (используется для разделения органических аминов). SAX - это сильный анионный обмен (используется для разделения соединений карбоновых кислот).
Смеси воды или водных буферов и органических растворителей используются для элюирования аналитов из обращенно-фазовой колонки. Растворители должны смешиваться с водой, и наиболее распространенными используемыми органическими растворителями являются ацетонитрил, метанол и тетрагидрофуран (ТГФ). Можно использовать другие растворители, такие как этанол или 2-пропанол (изопропиловый спирт). Элюирование может выполняться изократически (состав воды и растворителя не изменяется в процессе разделения) или с использованием градиента раствора (состав воды и растворителя изменяется в процессе разделения, обычно за счет уменьшения полярности). PH подвижной фазы может иметь важное значение для удержания аналита и может изменять селективность некоторых аналитов.
Заряженные аналиты можно разделить на колонке с обращенной фазой с помощью ионного спаривания (также называемого ионным взаимодействием). Этот метод известен как обращенно-фазовая ионно-парная хроматография.
