Войти
Механизм сплайсинга белков с участием интеинов. На этой схеме N-extein показан красным, интеин - черным, а C-extein - синим. X представляет собой атом кислорода или серы. Сплайсинг белка - это внутримолекулярная реакция определенного белка, в которой удаляется внутренний сегмент белка (называемый интеин ) из белка-предшественника с лигированием С-концевого и N-концевого внешних белков (называемых экстеинами ) с обеих сторон. Соединение сплайсинга белка-предшественника в основном представляет собой цистеин или серин, которые представляют собой аминокислоты, содержащие нуклеофильную сторону. цепочка. Известные в настоящее время реакции сплайсинга белков не требуют экзогенных кофакторов или источников энергии, таких как аденозинтрифосфат (АТФ) или гуанозинтрифосфат (GTP). Обычно сплайсинг связан только с сплайсингом пре-мРНК. Этот белок-предшественник содержит три сегмента - N-экстеин, за которым следует интеин, за которым следует C-экстеин . После сплайсинга полученный белок содержит N-extein, связанный с C-extein; этот продукт для сращивания также называют экстейном.
Первый интеин был обнаружен в 1988 году путем сравнения последовательностей между Neurospora crassa и морковь вакуолярная АТФаза (без интеина) и гомологичный ген дрожжей (с интеином), который впервые был описан как предполагаемый переносчик ионов кальция. В 1990 году Хирата и др. продемонстрировали, что дополнительная последовательность в гене дрожжей транскрибируется в мРНК и удаляется из белка-хозяина только после трансляции. С тех пор интеины были обнаружены во всех трех сферах жизни (эукариоты, бактерии и археи) и в вирусах.
Сплайсинг белков был неожиданным, и его механизмы были обнаружены двумя группами (Anraku и Stevens) в 1990 г. Они оба обнаружили Saccharomyces cerevisiae VMA1 в предшественнике вакуолярного фермента H- АТФазы. Аминокислотная последовательность N- и C-концов соответствует 70% последовательности ДНК вакуолярной Н-АТФазы других организмов, тогда как аминокислотная последовательность центрального положения соответствует 30% общей последовательности ДНК дрожжевые НО нуклеаза.
Многие гены имеют неродственные кодирующие интеин сегменты, вставленные в разные положения. По этим и другим причинам интеины (или, точнее, сегменты гена, кодирующие интеины) иногда называют эгоистичными генетическими элементами, но, возможно, правильнее будет назвать их паразитическими. Согласно геноцентричному взгляду на эволюцию, большинство генов «эгоистичны» лишь постольку, поскольку они конкурируют с другими генами или аллелями, но обычно они выполняют функцию для организмов, тогда как «паразитические генетические элементы», по крайней мере изначально не вносят положительного вклада в приспособленность организма.
В базе данных всех известных интеинов ([1] ) 113 известных интеинов присутствуют в эукариотах с минимальной длиной 138 аминокислот и максимальная длина 844 аминокислоты. Был обнаружен первый интеин, кодируемый геном VMA Saccharomyces cerevisiae. Позже они были обнаружены в грибах (аскомицеты, базидиомицеты, зигомицеты и хитриды), а также в различных белках. Было описано, что белок, отдаленно связанный с известными интеинами, содержащими белок, но тесно связанный с белками многоклеточных животных hedgehog, имеет последовательность интеина из Glomeromycota. Многие из недавно описанных интеинов содержат самонаводящиеся эндонуклеазы, и некоторые из них, по-видимому, активны. Обилие интеина в грибах указывает на боковой перенос генов, содержащих интеин. В то время как у эубактерий и архей в настоящее время известно 289 и 182 интеина. Неудивительно, что большая часть интеина у эубактерий и архей, как и у грибов, встроена в метаболический белок нуклеиновой кислоты.
Процесс начинается со сдвига NO или NS, когда боковая цепь первый остаток (серин, треонин или цистеин ) интеиновой части белка-предшественника нуклеофильно атакует пептидная связь остатка непосредственно перед ним (то есть конечный остаток N-экстеина) с образованием линейного сложного эфира (или тиоэфира ) промежуточного соединения. переэтерификация происходит, когда боковая цепь первого остатка C-экстеина атакует вновь образованный (тио) сложный эфир, чтобы освободить N-концевой конец интеина. Это образует разветвленный интермедиат, в котором N-extein и C-extein присоединены, хотя и не через пептидную связь. Последним остатком интеина всегда является аспарагин, а атом азота амида этой боковой цепи расщепляет пептидную связь между интеином и С-экстеином, в результате чего образуется свободный интеиновый сегмент с концевым циклическим имидом. Наконец, свободная аминогруппа C-экстеина теперь атакует (тио) сложный эфир, связывая N- и C-экстеины вместе. Сдвиг ON или SN приводит к образованию пептидной связи и функционального связанного белка.
Механизм эффекта сплайсинга является естественной аналогией с техникой химического получения белков среднего размера, называемой нативное химическое лигирование.
интеин представляет собой сегмент белка, который способен вырезать себя и присоединяться к оставшимся частям (экстеинов ) с пептидной связью во время сплайсинга белка. Интеины также называются интронами белка по аналогии с (РНК) интронами.
Первая часть названия интеина основана на научных имя организма, в котором он обнаружен, а вторая часть основана на названии соответствующего гена или экзестеина. Например, интеин, обнаруженный в Thermoplasma acidophilum и связанный с субъединицей A вакуолярной АТФазы (VMA), называется «Tac VMA».
Обычно, как в этом примере, достаточно всего трех букв, чтобы указать организм, но есть варианты. Например, могут быть добавлены дополнительные буквы для обозначения деформации. Если более одного интеина кодируется в соответствующем гене, интеинам дается числовой суффикс, начиная с 5 'до 3' или в порядке их идентификации (например, «Msm dnaB-1»).
Сегменту гена, который кодирует интеин, обычно дается то же имя, что и интеин, но во избежание путаницы имя собственно интеина обычно пишется с большой буквы (например, Pfu RIR1-1), тогда как имя соответствующего сегмента гена выделен курсивом (например, Pfu rir1-1).
Типы белков сплайсинга подразделяются на четыре класса: макси-интеин, мини-интеин, интеин транс-сплайсинга и аланин интеин. Макси-интеины представляют собой N- и C-концевые домены сплайсинга, содержащие эндонуклеазный домен. Мини-интеины представляют собой типичные N- и C-концевые домены сплайсинга; однако эндонуклеазный домен отсутствует. При транс-сплайсинге интеинов интеин расщепляется на два (или, возможно, более) домена, которые затем делятся на N-конец и C-конец. Интеины аланина имеют сплайсинговое соединение аланина вместо цистеина или серина, в обоих из которых происходит сплайсинг белка.
Интеины могут содержать домен гена самонаводящейся эндонуклеазы (HEG) в дополнение к доменам сплайсинга. Этот домен отвечает за распространение интеина путем расщепления ДНК по не содержащему интеина аллелю на гомологичной хромосоме, запуская репарацию двухцепочечных разрывов ДНК (DSBR), которая затем восстанавливает разрыв, копируя, таким образом, ДНК, кодирующую интеин, в ранее свободный от интеина сайт. Домен HEG не нужен для сплайсинга интеина, поэтому он может быть утерян, образуя минимальный или мини-интеин. Несколько исследований продемонстрировали модульную природу интеинов путем добавления или удаления доменов HEG и определения активности новой конструкции.
Иногда интеин белка-предшественника происходит от двух генов.. В этом случае интеин называется расщепленным интеином. Например, в цианобактериях, DnaE каталитическая субъединица α ДНК-полимеразы III кодируется двумя отдельными генами, dnaE-n и dnaE-c. Продукт dnaE-n состоит из последовательности N-extein, за которой следует последовательность интеина 123-AA, тогда как продукт dnaE-c состоит из последовательности интеина 36-AA, за которой следует последовательность C-extein. 87>
Интеины очень эффективны при сплайсинге белков, и, соответственно, они нашли важную роль в биотехнологии. На сегодняшний день идентифицировано более 200 интеинов; размеры варьируются от 100–800 AA. Интеины были разработаны для конкретных применений, таких как полусинтез белка и селективное мечение белковых сегментов, что полезно для исследований ЯМР больших белков.
Фармацевтическое ингибирование Удаление интеина может быть полезным инструментом разработки лекарств ; белок, содержащий интеин, не будет выполнять свою нормальную функцию, если интеин не вырезан, поскольку его структура будет нарушена.
Было высказано предположение, что интеины могут оказаться полезными для достижения аллотопной экспрессии некоторых высоко гидрофобных белков, обычно кодируемых митохондриальным геномом, для пример в генной терапии. Гидрофобность этих белков препятствует их импорту в митохондрии. Следовательно, вставка негидрофобного интеина может позволить этому импорту продолжаться. Вырезание интеина после импорта затем восстановит белок до дикого типа..
Аффинные метки широко используются для очистки рекомбинантных белков, поскольку они позволяют накапливать рекомбинантный белок с небольшими примесями. Однако аффинная метка должна быть удалена протеазами на последней стадии очистки. Этап дополнительного протеолиза поднимает проблемы специфичности протеазы при удалении аффинных меток из рекомбинантного белка и удалении продукта переваривания. Этой проблемы можно избежать путем слияния аффинной метки с саморасщепляемыми интеинами в контролируемой среде. В первом поколении экспрессионных векторов такого типа использовался модифицированный интеин Saccharomyces cerevisiae VMA (Sce VMA). Чонг и др. использовали хитинсвязывающий домен (CBD) из Bacillus circans в качестве аффинного тега и слили этот тег с модифицированным интеином Sce VMA. Модифицированный интеин подвергается реакции самоотщепления по своей N-концевой пептидной связи с 1,4-дитиотреитолом (DTT), β-меркаптоэтанолом (β-ME) или цистин при низких температурах в широком диапазоне pH. После экспрессии рекомбинантного белка гомогенат клеток пропускают через колонку, содержащую хитин. Это позволяет CBD химерного белка связываться с колонкой. Кроме того, когда температура понижается и описанные выше молекулы проходят через колонку, химерный белок подвергается самосплайсингу, и элюируется только целевой белок. Этот новый метод устраняет необходимость в стадии протеолиза, и модифицированный Sce VMA остается в колонке, прикрепленной к хитину посредством CBD.
Недавно интеины были использованы для очистки белков на основе самоагрегированных пептидов. Эластиноподобные полипептиды (ELP) - полезный инструмент в биотехнологии. Слитые с белком-мишенью, они имеют тенденцию образовывать агрегаты внутри клеток. Это исключает хроматографический этап, необходимый для очистки белка. Теги ELP были использованы в слитном белке интеина, так что агрегаты могут быть выделены без хроматографии (центрифугированием), а затем интеин и метка могут быть расщеплены контролируемым образом для высвобождения целевого белка в раствор. Это выделение белка может быть выполнено с использованием непрерывного потока среды, что дает большое количество белка, что делает этот процесс более экономичным, чем обычные методы. Другая группа исследователей использовала более мелкие самоагрегированные метки для выделения целевого белка. Небольшие амфипатические пептиды 18A и ELK16 (рисунок 5) были использованы для образования саморасщепляющегося агрегирующего белка.
