Войти
A белковый микрочип (или белковый чип ) - это высокопроизводительный Метод, используемый для отслеживания взаимодействий и активности белков, а также для определения их функции и определения функции в крупном масштабе. Его главное преимущество заключается в том, что большое количество белков можно отслеживать параллельно. Чип состоит из опорной поверхности, такие как стекло, нитроцеллюлозную мембрану, шарик, или микротитрационного планшета, в котором массив белков захвата связан. Зонд молекулы, как правило, помечены флуоресцентный краситель добавляются к массиву. Любая реакция между зондом и иммобилизованным белком испускает флуоресцентный сигнал, который считывается лазерным сканером . Белковые микрочипы являются быстрыми, автоматизированными, экономичными и высокочувствительными, потребляя небольшие количества образцов и реагентов. Концепция и методология белковых микроматриц были впервые представлены и проиллюстрированы в микроматрицах антител (также называемых матрицей антител ) в 1983 году в научной публикации и серии патентов. Высокопроизводительную технологию, лежащую в основе белковых микроматриц, было относительно легко разработать, поскольку она основана на технологии, разработанной для ДНК-микрочипов, которые стали наиболее широко используемыми микрочипами.
Белковые микрочипы были разработаны из-за ограничений использования ДНК-микрочипов для определения уровней экспрессии генов в протеомике. Количество мРНК в клетке часто не отражает уровни экспрессии белков, которым они соответствуют. Поскольку обычно именно белок, а не мРНК играет функциональную роль в клеточном ответе, потребовался новый подход. Кроме того, посттрансляционные модификации, которые часто имеют решающее значение для определения функции белка, не видны на микрочипах ДНК. Белковые микроматрицы заменяют традиционные методы протеомики, такие как 2D гель-электрофорез или хроматография, которые требовали много времени, трудозатратно и плохо подходили для анализа белков с низким содержанием.
Белки наносят на твердую поверхность, такую как предметные стекла микроскопа, мембраны, шарики или микротитровальные планшеты. Функция этой поверхности - обеспечить поддержку, на которой можно иммобилизовать белки. Он должен демонстрировать максимальные связывающие свойства при сохранении белка в его нативной конформации, чтобы его связывающая способность сохранялась. Предметные стекла для микроскопов из стекла или силикона являются популярным выбором, поскольку они совместимы с легко доступными роботизированными матрицами и лазерными сканерами, которые были разработаны для технологии микрочипов ДНК. Нитроцеллюлозные пленочные слайды широко признаны в качестве субстрата с наивысшим связыванием с белком для приложений с белковыми микрочипами.
Выбранная твердая поверхность затем покрывается покрытием, которое должно одновременно выполнять функции иммобилизации белка, предотвращения его денатурации, ориентации его в соответствующем направлении, чтобы его сайты связывания были доступны и обеспечение гидрофильной среды, в которой может происходить реакция связывания. Он также должен отображать минимальное неспецифическое связывание, чтобы минимизировать фоновый шум в системах обнаружения. Кроме того, он должен быть совместим с различными системами обнаружения. Иммобилизирующие агенты включают слои алюминия или золота, гидрофильные полимеры и полиакриламидные гели или обработку аминами, альдегидом или эпоксидной смолой. Для нанесения покрытия на поверхность носителя используются тонкопленочные технологии, такие как физическое осаждение из паровой фазы (PVD) и химическое осаждение из паровой фазы (CVD).
Водная среда необходима на всех этапах производства и эксплуатации массива для предотвращения денатурации белка. Таким образом, буферы для образцов содержат высокий процент глицерина (для снижения точки замерзания), а влажность производственной среды тщательно регулируется. Микролунки обладают двойным преимуществом: они обеспечивают водную среду и предотвращают перекрестное загрязнение между образцами.
В наиболее распространенном типе белкового массива роботы размещают большое количество белков или их лигандов на твердой основе с покрытием по заранее заданному шаблону. Это называется роботизированной контактной печатью или роботизированным пятном. Другой способ изготовления - это струйная печать, бесконтактный способ нанесения по требованию капель белковых полимеров на твердую поверхность по желаемому рисунку. Пьезоэлектрическое нанесение пятен аналогично метод струйной печати. Печатающая головка перемещается по матрице, и в каждой точке используется электрическая стимуляция для доставки молекул белка на поверхность с помощью крошечных струй. Это также бесконтактный процесс. Фотолитография - четвертый метод нанесения белков на поверхность. Свет используется в сочетании с фотошаблонами, непрозрачными пластинами с отверстиями или прозрачными пленками, которые позволяют свету проходить через определенный узор. Затем серия химических обработок позволяет отложить белок в желаемом виде на материале под фотомаской.
Улавливающие молекулы, расположенные на твердой поверхности, могут быть антителами,, антигенами., аптамеры (лиганды на основе нуклеиновых кислот), аффитела (небольшие молекулы, созданные для имитации моноклональных антител) или полноразмерные белки. Источники таких белков включают клеточные системы экспрессии рекомбинантных белков, очистку из природных источников, получение in vitro с помощью бесклеточных систем трансляции и синтетические методы. для пептидов. Многие из этих методов могут быть автоматизированы для получения высокой производительности, но следует соблюдать осторожность, чтобы избежать условий синтеза или экстракции, которые приводят к денатурированному белку, который, поскольку он больше не распознает своего партнера по связыванию, делает массив бесполезным.
Белки очень чувствительны к изменениям в их микросреде. Это представляет проблему в поддержании белковых массивов в стабильном состоянии в течение длительных периодов времени. Методы in situ, изобретенные и опубликованные Мингью Хе и Майклом Тауссигом в 2001 году, включают в себя синтез белков на кристалле по мере необходимости, непосредственно из ДНК с использованием систем бесклеточной экспрессии белков. Поскольку ДНК - очень стабильная молекула, она не разрушается со временем и поэтому подходит для длительного хранения. Этот подход также имеет преимущество в том, что он позволяет обойти трудоемкие и часто дорогостоящие процессы раздельной очистки белков и клонирования ДНК, поскольку белки создаются и иммобилизуются одновременно на одной стадии на поверхности чипа. Примерами методов in situ являются PISA (массив белков in situ), NAPPA (массив белков, программируемых нуклеиновыми кислотами) и DAPA (массив ДНК в массив белков).
Типы протеиновых массивов Существует три типа протеиновых микроматриц, которые в настоящее время используются для изучения биохимической активности протеинов.
Аналитические микроматрицы также известны как матрицы захвата. В этом методе библиотека антител, аптамеров или аффител размещается на поверхности носителя. Они используются в качестве молекул захвата, поскольку каждая специфично связывается с определенным белком. Массив исследуют сложным белковым раствором, таким как клеточный лизат . Анализ результирующих реакций связывания с использованием различных систем обнаружения может предоставить информацию об уровнях экспрессии определенных белков в образце, а также измерения аффинности и специфичности связывания. Этот тип микроматрицы особенно полезен для сравнения экспрессии белков в различных растворах. Например, ответ клеток на конкретный фактор может быть идентифицирован путем сравнения лизатов клеток, обработанных конкретными веществами или выращенных в определенных условиях, с лизатами контрольных клеток. Другое применение - идентификация и профилирование пораженных тканей.
Обратно-фазовый белковый микрочип (RPPA) включает сложные образцы, такие как лизаты тканей. Клетки выделяют из различных представляющих интерес тканей и лизируют. Лизат наносят на микроматрицу и исследуют антителами против интересующего целевого белка. Эти антитела обычно обнаруживаются с помощью хемилюминесцентного, флуоресцентного или колориметрического анализов. Эталонные пептиды напечатаны на предметных стеклах, чтобы можно было количественно определить содержание белка в образцах лизатов. RPA позволяют определить присутствие измененных белков или других агентов, которые могут быть результатом заболевания. В частности, посттрансляционные модификации, которые обычно изменяются в результате заболевания, могут быть обнаружены с помощью RPA.
Функциональные белковые микроматрицы (также известные как целевые белковые массивы) путем иммобилизации большого количества очищенных белков и используются для идентификации взаимодействий белок-белок, белок-ДНК, белок-РНК, белок-фосфолипид и белок-низкомолекулярных взаимодействий для анализа ферментативная активность и для обнаружения антител и демонстрации их специфичности. Они отличаются от аналитических массивов тем, что функциональные белковые массивы состоят из массивов, содержащих полноразмерные функциональные белки или белковые домены. Эти протеиновые чипы используются для изучения биохимической активности всего протеома в одном эксперименте.
Ключевым элементом любого анализа на основе функционального белкового микрочипа является то, что объединенные в матрицу белки должны сохранять свою естественную структуру, чтобы на поверхности матрицы могли происходить значимые функциональные взаимодействия. Преимущества контроля точного способа прикрепления к поверхности посредством использования соответствующей аффинной метки заключаются в том, что иммобилизованные белки будут иметь гомогенную ориентацию, что приведет к более высокой удельной активности и более высокому отношению сигнал / шум в анализах с меньшим вмешательством из-за отсутствия специфические взаимодействия.
Методы обнаружения белкового массива должны давать высокий сигнал и низкий фон. Наиболее распространенным и широко используемым методом обнаружения является флуоресцентная маркировка, которая отличается высокой чувствительностью, безопасностью и совместима с легко доступными лазерными сканерами на микрочипах. Могут использоваться другие метки, такие как аффинные, фотохимические или радиоизотопные метки. Эти метки прикрепляются к самому зонду и могут мешать реакции белка-мишени. Таким образом, доступен ряд методов обнаружения без меток, таких как поверхностный плазмонный резонанс (SPR), углеродные нанотрубки, датчики с углеродными нанопроводами (где обнаружение происходит через изменение проводимости) и кантилеверы микроэлектромеханической системы (MEMS). Все эти методы детектирования без метки являются относительно новыми и пока не подходят для детектирования взаимодействия белков с высокой пропускной способностью; тем не менее, они обещают многообещающее будущее. Иммуноанализы на тиоленовых микропиллярных каркасах из «синтетической бумаги» показали, что они генерируют превосходный сигнал флуоресценции.
Для количественного определения белка на стеклянных предметных стеклах, покрытых нитроцеллюлозой, можно использовать флуоресцентное детектирование в ближнем ИК-диапазоне. Это ограничивает помехи из-за автофлуоресценции нитроцеллюлозы на длинах волн УФ, используемых для стандартных флуоресцентных детекторов.
Существуют пять основных областей, в которых применяются белковые матрицы: диагностика, протеомика, функциональный анализ белков, характеристика антител и разработка методов лечения.
Диагностика включает обнаружение антигенов и антител в образцах крови; профилирование сывороток для обнаружения новых заболеваний биомаркеров ; мониторинг болезненных состояний и реакции на терапию в персонализированной медицине; мониторинг окружающей среды и продуктов питания. Цифровой биоанализ является примером использования белковых микрочипов в диагностических целях. В этой технологии массив микролунок на стеклянном / полимерном чипе засевается магнитными шариками (покрытыми флуоресцентными мечеными антителами), подвергается воздействию антигенов-мишеней и затем охарактеризован под микроскопом путем подсчета флуоресцентных лунок. Экономически эффективная платформа для изготовления (с использованием полимеров OSTE ) для таких массивов микролунок была недавно продемонстрирована, и модельная система биоанализа была успешно охарактеризована.
Протеомика относится к профилированию экспрессии белков, т.е. какие белки экспрессируются в лизате конкретной клетки.
Функциональный анализ белков - это идентификация белок-белковых взаимодействий (например, идентификация членов белкового комплекса), белок-фосфолипидных взаимодействий, малых молекул-мишеней, ферментативных субстратов (особенно субстратов киназы ) и лиганды рецепторов.
Характеристика антител характеризует перекрестную реактивность, специфичность и картирование эпитопов.
Разработка лечения включает разработку антиген-специфических методов лечения аутоиммунитета, рака и аллергии; идентификация малых молекул-мишеней, которые потенциально могут быть использованы в качестве новых лекарств.
Несмотря на значительные инвестиции, сделанные несколькими компаниями, протеиновые чипы еще не наводнили рынок. Производители обнаружили, что с белками на самом деле довольно сложно работать. Производство надежных, последовательных, высокопроизводительных белков, которые правильно сложены и функциональны, сопряжено с трудностями, поскольку они часто приводят к низкому выходу белков из-за пониженной растворимости и образования телец включения. Для создания белкового чипа требуется гораздо больше этапов, чем для создания ДНК-чипа.
. Существует ряд подходов к решению этой проблемы, которые фундаментально различаются в зависимости от того, иммобилизованы ли белки посредством неспецифических, плохо определенных взаимодействий. или через определенный набор известных взаимодействий. Первый подход привлекателен своей простотой и совместим с очищенными белками, полученными из нативных или рекомбинантных источников, но страдает рядом рисков. Наиболее заметные из них относятся к неконтролируемому характеру взаимодействий между каждым белком и поверхностью; в лучшем случае это могло бы дать начало гетерогенной популяции белков, в которых активные центры иногда перекрываются поверхностью; в худшем случае он может полностью уничтожить активность из-за частичного или полного поверхностно-опосредованного разворачивания иммобилизованного белка.
Проблемы включают: 1) поиск поверхности и метода прикрепления, который позволяет белкам сохранять свою вторичную или третичную структуру и, следовательно, их биологическую активность и их взаимодействие с другими молекулами, 2) производство массива с длительным сроком хранения, чтобы белки на чипе не денатурировались за короткое время, 3) идентификация и выделение антител или других молекул захвата против каждого белка в геноме человека, 4) количественная оценка уровней связанного белка при одновременном обеспечение чувствительности и избежание фонового шума, 5) извлечение детектируемого белка из чипа для его дальнейшего анализа, 6) уменьшение неспецифического связывания захватывающими агентами, 7) емкость чипа должна быть достаточной для того, чтобы обеспечить полное представление протеома, который нужно визуализировать, насколько это возможно; обильные белки подавляют обнаружение менее распространенных белков, таких как сигнальные молекулы и рецепторы, которые обычно представляют больший терапевтический интерес.
