Войти
Пре-мРНК - это первая форма РНК, созданная путем транскрипции при синтезе белка. Пре-мРНК не имеет структур, необходимых для матричной РНК (мРНК). Сначала все интроны должны быть удалены из транскрибируемой РНК с помощью процесса, известного как сплайсинг. Перед тем, как РНК будет готова к экспорту, к 3 'концу РНК добавляется хвост Poly (A), а к 5' концу - 5 '. 
Микрофотография транскрипции гена рибосомной РНК, иллюстрирующая рост первичные транскрипты A первичный транскрипт представляет собой одноцепочечный продукт рибонуклеиновой кислоты (РНК ), синтезированный с помощью транскрипции ДНК и обработанный для получения различных продукты зрелой РНК, такие как мРНК, тРНК и рРНК. Первичные транскрипты, обозначенные как мРНК, модифицируются при подготовке к трансляции. Например, мРНК-предшественник (пре-мРНК ) представляет собой тип первичного транскрипта, который становится матричной РНК (мРНК) после обработки.
синтезируется пре-мРНК. из матрицы ДНК в ядре клетки с помощью транскрипции. Пре-мРНК включает основную часть гетерогенной ядерной РНК (hnRNA ). После того, как пре-мРНК была полностью процессирована, ее называют «зрелой информационной РНК » или просто «матричной РНК ». Термин hnRNA часто используется как синоним пре-мРНК, хотя в строгом смысле hnRNA может включать в себя транскрипты ядерной РНК, которые не превращаются в цитоплазматическую мРНК.
Есть несколько этапов, которые способствуют производству первичных транскриптов. Все эти шаги включают серию взаимодействий для инициации и завершения транскрипции ДНК в ядре эукариот. Определенные факторы играют ключевую роль в активации и ингибировании транскрипции, где они регулируют производство первичных транскриптов. Транскрипция производит первичные транскрипты, которые в дальнейшем модифицируются несколькими процессами. Эти процессы включают 5 'кэп, 3'-полиаденилирование и альтернативный сплайсинг. В частности, альтернативный сплайсинг напрямую способствует разнообразию мРНК, обнаруживаемой в клетках. Модификации первичных транскриптов были дополнительно изучены в исследованиях, направленных на получение более глубоких знаний о роли и значении этих транскриптов. Экспериментальные исследования, основанные на молекулярных изменениях первичных транскриптов и процессов до и после транскрипции, привели к большему пониманию заболеваний, связанных с первичными транскриптами.
Этапы, способствующие производству первичных транскриптов, включают серию молекулярных взаимодействий, которые инициируют транскрипцию ДНК в ядре клетки. В зависимости от потребностей данной клетки определенные последовательности ДНК транскрибируются для получения различных продуктов РНК, которые транслируются в функциональные белки для использования в клетке. Чтобы инициировать процесс транскрипции в ядре клетки, двойные спирали ДНК разматываются и водородные связи, соединяющие совместимые нуклеиновые кислоты ДНК, разрываются с образованием двух несвязанных одиночных цепей ДНК. Одна цепь ДНК-матрицы используется для транскрипции одноцепочечной мРНК первичного транскрипта. Эта цепь ДНК связана с РНК-полимеразой в промоторной области ДНК.
Транскрипция ДНК с помощью РНК-полимеразы для получения первичного транскрипта У эукариот три вида РНК - рРНК, тРНК и мРНК - продуцируются на основе активности трех различных РНК-полимераз, тогда как у прокариот существует только одна РНК-полимераза создавать всевозможные молекулы РНК. РНК-полимераза II эукариот транскрибирует первичный транскрипт, транскрипт, предназначенный для обработки в мРНК, из антисмысловой ДНК-матрицы в направлении от 5 'к 3', и этот вновь синтезированный первичный транскрипт комплементарен антисмысловому цепь ДНК. РНК-полимераза II конструирует первичный транскрипт с использованием набора из четырех специфических рибонуклеозидных монофосфатных остатков (аденозинмонофосфат (AMP), цитидинмонофосфат (CMP), гуанозинмонофосфат (GMP) и уридинмонофосфат (UMP)), которые непрерывно добавляются к 3'-гидроксильной группе на 3'-конце растущей мРНК.
Исследования первичные транскрипты, продуцируемые РНК-полимеразой II, показывают, что средняя длина первичного транскрипта составляет 7000 нуклеотидов в длину, при этом длина некоторых увеличивается до 20 000 нуклеотидов. Включение последовательностей экзона и интрона в первичные транскрипты объясняет разницу в размерах между более крупными первичными транскриптами и более мелкой зрелой мРНК, готовой к трансляции в белок.
Ряд факторов способствует активации и ингибированию транскрипции и, следовательно, регулирует продукцию первичных транскриптов из данной матрицы ДНК.
Активация активности РНК-полимеразы с образованием первичных транскриптов часто контролируется последовательностями ДНК, называемыми энхансерами. Факторы транскрипции, белки, которые связываются с элементами ДНК для активации или подавления транскрипции, связываются с энхансерами и рекрутируют ферменты, которые изменяют компоненты нуклеосомы, в результате чего ДНК становится более или менее доступной для РНК полимераза. Уникальные комбинации либо активирующих, либо ингибирующих факторов транскрипции, которые связываются с участками энхансерной ДНК, определяют, активируется ли ген, с которым взаимодействует энхансер, для транскрипции или нет. Активация транскрипции зависит от того, может ли комплекс элонгации транскрипции, состоящий из множества факторов транскрипции, вызывать диссоциацию РНК-полимеразы от комплекса Медиатор, который соединяет область энхансера с промотором.
Роль факторов транскрипции и энхансеров в регуляции экспрессии генов Ингибирование активности РНК-полимеразы также может регулироваться последовательностями ДНК, называемыми сайленсерами. Подобно энхансерам, сайленсеры могут располагаться дальше вверх или вниз от генов, которые они регулируют. Эти последовательности ДНК связываются с факторами, которые способствуют дестабилизации комплекса инициации, необходимого для активации РНК-полимеразы, и, следовательно, ингибируют транскрипцию.
Модификация гистона факторами транскрипции является еще одним ключевым регуляторным фактором транскрипции с помощью РНК-полимеразы. Как правило, факторы, которые приводят к ацетилированию гистона , активируют транскрипцию, тогда как факторы, ведущие к деацетилированию гистона , ингибируют транскрипцию. Ацетилирование гистонов вызывает отталкивание отрицательных компонентов в нуклеосомах, обеспечивая доступ РНК-полимеразе. Деацетилирование гистонов стабилизирует плотно свернутые нуклеосомы, ингибируя доступ РНК-полимеразы. В дополнение к паттернам ацетилирования гистонов паттерны метилирования в промоторных областях ДНК могут регулировать доступ РНК-полимеразы к данной матрице. РНК-полимераза часто неспособна синтезировать первичный транскрипт, если промоторная область целевого гена содержит специфические метилированные цитозины - остатки, которые препятствуют связыванию факторов, активирующих транскрипцию, и привлекают другие ферменты для стабилизации прочно связанной структуры нуклеосом, исключая доступ к РНК-полимеразе и предотвращая производство первичных транскриптов.
R-петли образуются во время транскрипции. R-петля представляет собой трехцепочечную структуру нуклеиновой кислоты, содержащую гибридную область ДНК-РНК и связанную нематричную одноцепочечную ДНК. Активно транскрибируемые области ДНК часто образуют R-петли, которые уязвимы для повреждения ДНК. Интроны уменьшают образование R-петли и повреждение ДНК в высокоэкспрессируемых генах дрожжей.
Транскрипция, строго регулируемая фаза экспрессии генов, дает первичные транскрипты. Однако транскрипция - это только первый шаг, за которым должны следовать многие модификации, дающие функциональные формы РНК. Иначе говоря, вновь синтезированные первичные транскрипты модифицируются несколькими способами для преобразования в их зрелые функциональные формы с образованием различных белков и РНК, таких как мРНК, тРНК и рРНК.
Основной процесс модификации первичного транскрипта подобен для тРНК и рРНК как в эукариотических, так и в прокариотических клетках. С другой стороны, процессинг первичного транскрипта варьируется в мРНК прокариотических и эукариотических клеток. Например, некоторые мРНК прокариотических бактерий служат матрицами для синтеза белков, в то же время, когда они продуцируются посредством транскрипции. С другой стороны, пре-мРНК эукариотических клеток претерпевает широкий спектр модификаций до их транспорта из ядра в цитоплазму, где транслируются их зрелые формы. Эти модификации отвечают за различные типы закодированных сообщений, которые приводят к переводу различных типов продуктов. Кроме того, процессинг первичного транскрипта обеспечивает контроль экспрессии генов, а также регуляторный механизм скорости деградации мРНК. Процессинг пре-мРНК в эукариотических клетках включает 5 'кэппинг, 3' полиаденилирование и альтернативный сплайсинг.
вскоре после транскрипция инициируется у эукариот, 5'-конец пре-мРНК модифицируется путем добавления 7-метилгуанозинового кэпа, также известного как 5'-кэп. Модификация 5'-кэппинга инициируется добавлением GTP к 5'-концевому нуклеотиду пре-мРНК в обратной ориентации с последующим добавлением метильных групп к остатку G. 5'-кэппинг необходим для производства функциональных мРНК, поскольку 5'-кэп отвечает за выравнивание мРНК с рибосомой во время трансляции.
У эукариот полиаденилирование дополнительно модифицирует пре-мРНК во время которого добавляется структура под названием poly-A tail. Сигналы полиаденилирования, которые включают несколько элементов последовательности РНК, обнаруживаются группой белков, которые сигнализируют о добавлении поли-А-хвоста (длиной примерно 200 нуклеотидов). Реакция полиаденилирования обеспечивает сигнал об окончании транскрипции, и эта реакция заканчивается примерно на несколько сотен нуклеотидов ниже места поли-A-хвоста.
Пре-мРНК эукариот имеют свои интроны сплайсированный сплайсосомами, состоящими из малых ядерных рибонуклеопротеинов.
. В сложных эукариотических клетках один первичный транскрипт способен получать большие количества зрелых мРНК за счет альтернативного сплайсинга. Альтернативный сплайсинг регулируется таким образом, что каждая зрелая мРНК может кодировать множество белков.
Альтернативный сплайсинг первичного транскрипта Эффект альтернативного сплайсинга в экспрессии генов можно наблюдать у сложных эукариот, которые имеют фиксированное количество генов в своем геноме, но продуцируют гораздо большее количество различных генных продуктов. Большинство транскриптов пре-мРНК эукариот содержат несколько интронов и экзонов. Различные возможные комбинации 5'- и 3'-сайтов сплайсинга в пре-мРНК могут привести к различному вырезанию и комбинации экзонов, в то время как интроны удаляются из зрелой мРНК. Таким образом, генерируются различные виды зрелых мРНК. Альтернативный сплайсинг имеет место в большом белковом комплексе, называемом сплайсосомой. Альтернативный сплайсинг имеет решающее значение для тканеспецифической регуляции экспрессии генов и регуляции развития. На альтернативный сплайсинг могут влиять различные факторы, включая мутации, такие как хромосомная транслокация.
У прокариот сплайсинг осуществляется посредством автокаталитического расщепления или эндолитического расщепления. Автокаталитическое расщепление, в котором не участвуют белки, обычно зарезервировано для участков, кодирующих рРНК, тогда как эндолитическое расщепление соответствует предшественникам тРНК.
Исследование Синди Л. Уиллс и Брюса Дж. Дольника из отдела экспериментальной терапии в Мемориальном институте Розуэлл-Парк в Буффало, штат Нью-Йорк, и из программы клеточной и молекулярной биологии в Университете Висконсина в Мэдисоне, штат Висконсин, научили понимать клеточные процессы с участием первичных транскриптов. Исследователи хотели выяснить, подавляет ли 5- фторурацил (FUra), лекарство, известное своим применением для лечения рака, или блокирует ли процессинг пре-мРНК дигидрофолатредуктазы (DHFR) и / или ядерный Стабильность мРНК в метотрексат -устойчивых КБ-клетках. Длительное воздействие FUra не влияло на уровень пре-мРНК DHFR, содержащей определенные интроны, которые представляют собой участки пре-мРНК, которые обычно вырезаются из последовательности в ходе процессинга. Однако уровни общей мРНК DHFR снижались в два раза в клетках, подвергнутых воздействию 1,0 мкМ FUra. Не наблюдалось значительных изменений в периоде полужизни, который относится ко времени, необходимому для распада 50% мРНК, общей мРНК DHFR или пре-мРНК, наблюдаемых в клетках, подвергнутых воздействию FUra. И эксперименты по мечению ядерной / цитоплазматической РНК продемонстрировали, что скорость превращения ядерной РНК DHFR в цитоплазматическую мРНК DHFR снижалась в клетках, обработанных FUra. Эти результаты служат дополнительным доказательством того, что FUra может помочь в процессинге предшественников мРНК и / или влиять на стабильность ядерной мРНК DHFR.
Джудит Ленджел и Шелдон Пенман из отдела биологии в Массачусетском институте Technology (MIT) из Кембриджа, штат Массачусетс, написала статью об одном типе первичного транскрипта, задействованном в генах двух двукрылых или насекомых с двумя крыльями: Drosophila и Аедес. В статье описывается, как исследователи изучали первичные транскрипты гяРНК или пре-мРНК у двух видов насекомых. Сравнивали размер транскриптов hnRNA и фракцию hnRNA, которая превращается в мРНК в клеточных линиях или группах клеток, полученных из одной клетки любого объекта, изучаемого Drosophila melanogaster и Aedes albopictus. Оба насекомых двукрылые, но у Aedes более крупный геном, чем у Drosophila. Это означает, что у Aedes больше ДНК, а значит, больше генов. Линия Aedes производит более крупную hnRNA, чем линия Drosophila, даже несмотря на то, что две клеточные линии росли в аналогичных условиях и продуцировали зрелую или процессированную мРНК одинакового размера и сложности последовательности. Эти данные позволяют предположить, что размер гяРНК увеличивается с увеличением размера генома, что, очевидно, продемонстрировал Аедес.
Иво Мелчак, Степанка Мелчакова, Войтех Копский, Яромира Весерова и Иван Раска из отдела клеточной биологии Института из экспериментальной медицины в Академии наук Чешской Республики в Праге изучал влияние ядерных спеклов на пре-мРНК. Ядерные спеклы (спеклы) являются частью ядер клеток и обогащены факторами сплайсинга, известными своей вовлеченностью в процессинг мРНК. Было показано, что ядерные спеклы служат соседним активным генам в качестве хранилищ этих факторов сплайсинга. В этом исследовании исследователи показали, что в клетках HeLa, полученных из клеток человека, страдающего раком шейки матки, и доказавших свою полезность для экспериментов, первая группа сплайсосом на пре-мРНК происходит из этих крапинок. Исследователи использовали микроинъекции пре-мРНК акцептора сплайсосомы и мутантного аденовируса с дифференциальным связыванием факторов сплайсинга, чтобы сформировать разные группы, а затем проследили сайты, в которых они в значительной степени присутствовали. Принимающие сплайсосомы пре-мРНК быстро направлялись в спеклы, но было обнаружено, что нацеливание зависит от температуры. Последовательности полипиримидинового тракта в мРНК способствуют созданию групп сплайсосом и необходимы для нацеливания, но сами по себе этого недостаточно. Нижеследующие фланкирующие последовательности были особенно важны для нацеливания на мутантные пре-мРНК в спеклах. В поддерживающих экспериментах за поведением спеклов наблюдали после микроинъекции антисмысловых дезоксиолигорибонуклеотидов (комплементарные последовательности ДНК и / или РНК к определенной последовательности) и, в данном случае, специфических последовательностей мяРНК. snRNA также известны тем, что помогают в процессинге пре-мРНК. В этих условиях группы сплайсосом образуются на эндогенных пре-мРНК. Исследователи пришли к выводу, что группы сплайсосом на микроинъектированной пре-мРНК образуются внутри спеклов. Нацеливание и накопление пре-мРНК в спеклах является результатом загрузки факторов сплайсинга на пре-мРНК, и группы сплайсосом привели к наблюдаемому пестрому паттерну.
Исследования также привели к получению большего количества знаний об определенных заболеваниях, связанных с изменениями в первичных транскриптах. Одно исследование включало рецепторы эстрогена и дифференциальный сплайсинг. В статье Паолы Ферро, Алессандры Форлани, Марко Музелли и Ульриха Пфеффера из лаборатории молекулярной онкологии Национального института онкологических исследований в Генуе, Италия, говорится в статье «Альтернативный сплайсинг первичного транскрипта альфа-рецептора эстрогена человека: механизмы пропуска экзона». что 1785 нуклеотидов области в ДНК, которая кодирует рецептор эстрогена альфа (ER-альфа), распределены по области, содержащей более 300 000 нуклеотидов в первичном транскрипте. Сплайсинг этой пре-мРНК часто приводит к вариантам или различным видам мРНК, лишенным одного или нескольких экзонов или областей, необходимых для кодирования белков. Эти варианты были связаны с прогрессированием рака груди. В жизненном цикле ретровирусов провирусная ДНК включается в транскрипцию ДНК инфицированной клетки. Поскольку ретровирусам необходимо преобразовать свою пре-мРНК в ДНК, чтобы эта ДНК могла быть интегрирована в ДНК хозяина, на которого она влияет, формирование этой ДНК-матрицы является жизненно важным шагом для репликации ретровируса. Тип клетки, дифференцировка или изменение состояния клетки, а также физиологическое состояние клетки приводят к значительному изменению доступности и активности определенных факторов, необходимых для транскрипции. Эти переменные создают широкий диапазон экспрессии вирусных генов. Например, клетки тканевой культуры, активно продуцирующие инфекционные вирионы вирусов птичьего или мышиного лейкоза (ASLV или MLV), содержат такие высокие уровни вирусной РНК, что 5–10% мРНК в клетке могут иметь вирусное происхождение.. Это показывает, что первичные транскрипты, продуцируемые этими ретровирусами, не всегда следуют нормальному пути к продукции белка и конвертируются обратно в ДНК для размножения и расширения.
