Фосфоенолпируваткарбоксилаза

Фосфоенолпируваткарбоксилаза (также известная как PEP карбоксилаза, PEPCase, или PEPC ; EC 4.1.1.31, PDB ID: 3ZGE) представляет собой фермент из семейства карбоксилиаз, обнаруженных в растениях. и некоторые бактерии, которые катализируют добавление бикарбоната (HCO 3) к фосфоенолпирувату (PEP) с образованием четырехуглеродного соединения оксалоацетат и неорганический фосфат :

PEP + HCO 3 → оксалоацетат + Pi

Эта реакция используется для фиксации углерода в CAM (крассулацевая кислота метаболизм) и C4 организмов, а также для регулирования потока через цикл лимонной кислоты (также известный как Кребса или TCA цикл) у бактерий и растений. Структура фермента и его двухступенчатый каталитический необратимый механизм хорошо изучены. Карбоксилаза PEP высоко регулируется как фосфорилированием, так и аллостерией.

Содержание

1 Структура фермента
2 Механизм фермента
3 Функция
4 Регламент
5 Ссылки

Структура фермента

Фермент PEP карбоксилаза присутствует в растениях и некоторых типах бактерий, но не в грибах или животных (включая человека). Гены у разных организмов различаются, но строго консервативны вокруг активных и аллостерических сайтов, обсуждаемых в разделах о механизмах и регуляции. Третичная структура фермента также сохраняется.

Кристаллическая структура PEP-карбоксилазы у многих организмов, включая Zea mays (кукуруза) и Escherichia coli определено. В целом фермент существует в виде димера-димера: две идентичные субъединицы тесно взаимодействуют с образованием димера через солевые мостики между аргинином (R438 - точные положения могут варьироваться в зависимости от происхождения гена) и остатки глутаминовой кислоты (E433). Этот димер собирается (более свободно) с другим в своем роде с образованием комплекса из четырех субъединиц. Субъединицы мономера в основном состоят из альфа-спиралей (65%) и имеют массу 106 кДа каждая. Длина последовательности составляет около 966 аминокислот.

Активный сайт фермента полностью не охарактеризован. Он включает консервативную аспарагиновую кислоту (D564) и остаток глутаминовой кислоты (E566), которые нековалентно связывают ион двухвалентного металла кофактор через функциональные группы карбоновой кислоты. Этот ион металла может быть магнием, марганцем или кобальтом в зависимости от организма, и его роль заключается в координации молекулы фосфоенолпирувата, а также промежуточных продуктов реакции. Считается, что остаток гистидина (H138) в активном центре способствует переносу протона во время каталитического механизма.

Ферментный механизм

Механизм действия PEP-карбоксилазы хорошо изучен. Ферментативный механизм образования оксалоацетата очень экзотермичен и, следовательно, необратим; биологическое изменение свободной энергии Гиббса (G ° ’) составляет -30 кДжмоль. субстраты и кофактор связываются в следующем порядке: металлический кофактор (либо Co, Mg, либо Mn), PEP, бикарбонат (HCO 3). Механизм состоит из двух основных этапов, как описано ниже и показано на рисунке 2:

Рисунок 2: ферментативный механизм фосфоенолпируват (PEP) карбоксилазы, превращающий бикарбонат и PEP в оксалоацетат и фосфат.

Бикарбонат действует как нуклеофил для атаки на фосфатную группу в PEP. Это приводит к расщеплению PEP на карбоксифосфат и (очень реактивную) енолат форму пирувата.
Перенос протона происходит на карбоксифосфате. Скорее всего, это модулируется остатком гистидина (H138), который сначала депротонирует карбоксильную сторону, а затем, как кислота, протонирует фосфатную часть. Затем карбоксифосфат экзотермически разлагается на диоксид углерода и неорганический фосфат, что делает эту реакцию необратимой. Наконец, после разложения диоксид углерода подвергается действию енолята с образованием оксалоацетата.

Металлический кофактор необходим для координации промежуточных продуктов енолята и диоксида углерода; молекула CO 2 теряется только в 3% случаев. Активный сайт гидрофобен, чтобы исключить воду, поскольку карбоксифосфатный промежуточный продукт подвержен гидролизу.

Функция

Три наиболее важные роли, которые выполняет карбоксилаза PEP В метаболизме растений и бактерий участвуют C4цикл, цикл CAM и цикл лимонной кислоты поток биосинтеза.

Основной механизм ассимиляции углекислого газа в растениях осуществляется через фермент рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза / оксигеназа (также известный как RuBisCO ), который добавляет CO 2 в рибулозо-1,5-бисфосфат (5 углеродных сахаров) с образованием двух молекул 3-фосфоглицерата (2x3 углеродных сахара). Однако при более высоких температурах и более низких концентрациях CO 2 RuBisCO добавляет кислород вместо диоксида углерода для образования непригодного для использования продукта гликолята в процессе, называемом фотодыхание. Чтобы предотвратить этот расточительный процесс, заводы увеличивают локальную концентрацию CO 2 в процессе, называемом C4циклом. PEP-карбоксилаза играет ключевую роль в связывании CO 2 в форме бикарбоната с PEP с образованием оксалоацетата в ткани мезофилла. Затем он превращается обратно в пируват (через промежуточное соединение малат ), чтобы высвободить CO 2 в более глубоком слое клеток оболочки пучка для фиксации углерода с помощью RuBisCO и цикла Кальвина. Пируват снова превращается в PEP в клетках мезофилла, и цикл начинается снова, таким образом активно накачивая CO 2.

. Второе важное и очень похожее биологическое значение PEP-карбоксилазы связано с циклом CAM. Этот цикл характерен для организмов, живущих в засушливых местах обитания. Растения не могут позволить себе открывать устьица в течение дня для поглощения CO 2, так как они теряют слишком много воды из-за транспирации. Вместо этого устьица открываются ночью, когда испарение воды минимально, и поглощают CO 2 путем фиксации PEP с образованием оксалоацетата через PEP-карбоксилазу. Оксалоацетат превращается в малат с помощью малатдегидрогеназы и хранится для использования в течение дня, когда светозависимая реакция генерирует энергию (в основном в форме ATP ) и восстанавливающие эквиваленты, такие как NADPH, для запуска цикла Кальвина.

В-третьих, карбоксилаза PEP играет важную роль в нефотосинтетических метаболических путях. На рисунке 3 показан этот метаболический поток (и его регуляция). Подобно пируваткарбоксилазе, PEP-карбоксилаза восполняет оксалоацетат в цикле лимонной кислоты. В конце гликолиза PEP превращается в пируват, который превращается в ацетил-кофермент-A (ацетил-CoA ), который переходит в лимонную кислоту. цикл путем взаимодействия с оксалоацетатом с образованием цитрата. Чтобы увеличить поток через цикл, часть PEP превращается в оксалоацетат с помощью PEP-карбоксилазы. Поскольку промежуточные соединения цикла лимонной кислоты обеспечивают центр метаболизма, увеличение потока важно для биосинтеза многих молекул, таких как, например, аминокислоты.

Регулирование

Рис. 3: Фосфоенолпируват (PEP) пути регуляции карбоксилазы

PEP-карбоксилаза в основном регулируется двумя уровнями: фосфорилированием и аллостерией. На рисунке 3 представлена схема регуляторного механизма.

Фосфорилирование фосфоенолпируваткарбоксилазой киназой включает фермент, тогда как фосфоенолпируваткарбоксилаза фосфатаза отключает его. И киназа, и фосфат регулируются транскрипцией. Также считается, что малат действует как ингибитор обратной связи уровней экспрессии киназ и как активатор экспрессии фосфатазы (транскрипции). Поскольку оксалоацетат превращается в малат в организмах CAM и C 4, высокие концентрации малата активируют экспрессию фосфатазы - фосфатаза впоследствии де-фосфорилирует и, таким образом, деактивирует карбоксилазу PEP, что приводит к отсутствию дальнейшего накопления оксалоацетата и, следовательно, нет дальнейшего превращения оксалоацетата в малат. Следовательно, производство малата подавляется.

Основными аллостерическими ингибиторами PEP-карбоксилазы являются карбоновые кислоты малат (слабый) и аспартат (сильный). Поскольку малат образуется на следующем этапе циклов CAM и C 4 после того, как карбоксилаза PEP катализирует конденсацию CO 2 и PEP в оксалоацетат, это работает как путь ингибирования с обратной связью. Оксалоацетат и аспартат легко взаимно превращаются через механизм трансаминазы ; таким образом, высокие концентрации аспартата также являются путем ингибирования PEP-карбоксилазы по принципу обратной связи.

Основными аллостерическими активаторами PEP-карбоксилазы являются ацетил-CoA и фруктозо-1,6-бисфосфат (F-1,6-BP). Обе молекулы являются индикаторами повышенных уровней гликолиза и, следовательно, положительных эффекторов PEP карбоксилазы с прямой связью. Они сигнализируют о необходимости производства оксалоацетата, чтобы обеспечить больший поток через цикл лимонной кислоты. Кроме того, повышенный гликолиз означает, что доступен более высокий запас PEP и, следовательно, большая емкость для связывания CO 2 при транспортировке в цикл Кальвина. Также следует отметить, что отрицательные эффекторы аспартат конкурируют с положительными эффекторными ацетил-КоА, что позволяет предположить, что они имеют общий аллостерический сайт связывания.

Исследования показали, что энергетические эквиваленты, такие как AMP, ADP и ATP, не оказывают значительного влияния на карбоксилазу PEP.