Войти
Фенилаланингидроксилаза (PAH ) (EC 1.14.16.1 ) представляет собой фермент, который катализирует гидроксилирование ароматической боковой цепи фенилаланина с образованием тирозина. ПАУ является одним из трех членов биоптерин -зависимых гидроксилаз ароматических аминокислот, класса монооксигеназ, которые используют тетрагидробиоптерин (BH 4, кофактор птеридина ) и негемовое железо для катализа. Во время реакции молекулярный кислород гетеролитически расщепляется с последовательным включением одного атома кислорода в BH 4 и фенилаланиновый субстрат.
 Реакция, катализируемая PAH |
Фенилаланингидроксилазой, является ограничивающим скорость фермент метаболического пути, который расщепляет избыток фенилаланина. Исследование фенилаланингидроксилазы Сеймуром Кауфманом привело к открытию тетрагидробиоптерина в качестве биологического кофактора. Фермент также представляет интерес с точки зрения здоровья человека, поскольку мутации в PAH, кодирующем гене, могут привести к фенилкетонурии, тяжелому метаболическому расстройству.
Предполагается, что реакция проходит через следующие этапы:
Механизм ПАУ, часть I Образование и расщепление железо-пероксиптеринового мостика. Хотя доказательства убедительно подтверждают Fe (IV) = O в качестве промежуточного гидроксилирующего соединения, детали механизма, лежащие в основе образования мостика Fe (II) -OO-BH 4 перед гетеролитическим расщеплением, остаются спорными. Были предложены два пути, основанные на моделях, которые различаются близостью железа к кофактору птерина и числом молекул воды, которые, как предполагается, координируются железом во время катализа. Согласно одной модели комплекс железа с диоксидом кислорода первоначально образуется и стабилизируется как резонансный гибрид FeO 2 и FeO 2. Активированный O 2 затем атакует BH 4, образуя переходное состояние, характеризующееся разделением зарядов между электронодефицитным птериновым кольцом и богатыми электронами дикислородом. Впоследствии образуется мостик Fe (II) -O-O-BH4. С другой стороны, формирование этого мостика моделировалось в предположении, что BH4 находится в первой координационной оболочке железа и что железо не координируется с какими-либо молекулами воды. Эта модель предсказывает другой механизм с участием радикала птерина и супероксида в качестве критических промежуточных продуктов. После образования мостик Fe (II) -O-O-BH 4 разрушается посредством гетеролитического расщепления связи O-O с Fe (IV) = O и 4a-гидрокситетрагидробиоптерином; таким образом, молекулярный кислород является источником обоих атомов кислорода, используемых для гидроксилирования кольца птерина и фенилаланина.
Механизм ПАУ, часть II Гидроксилирование фенилаланина промежуточным феррилоксо. Поскольку механизм включает промежуточное соединение гидроксилирования Fe (IV) = O (в отличие от пероксиптерина), окисление BH 4 кофактор и гидроксилирование фенилаланина могут быть разделены, что приводит к непродуктивному потреблению BH4 и образованию H2O2. Однако при продуктивности промежуточное соединение Fe (IV) = O добавляется к фенилаланину в реакции электрофильного ароматического замещения, которая восстанавливает железо из феррила в двухвалентное состояние. Хотя изначально был предложен ареноксид или радикальный промежуточный продукт, анализ родственных триптофана и тирозингидроксилаз показал, что реакция вместо этого протекает через катионный промежуточный продукт, который требует, чтобы Fe (IV) = O координировался с водным лигандом, а не с гидроксогруппой.. Этот катионный промежуточный продукт впоследствии подвергается 1,2-гидридному NIH-сдвигу с образованием промежуточного диенона, который затем таутомеризуется с образованием тирозинового продукта. Кофактор птерина регенерируется путем гидратации карбиноламинового продукта ПАУ до хиноноидного дигидробиоптерина (qBH 2), который затем восстанавливается до BH 4.
PAH предлагается использовать морфеин модель аллостерической регуляции.
ПАУ млекопитающих существует в равновесии, состоящем из тетрамеров двух различных архитектур, с одной или несколькими димерными формами как частью равновесия. Такое поведение согласуется с диссоциативным аллостерическим механизмом.
Многие исследования показывают, что ПАУ млекопитающих демонстрирует поведение, сравнимое с порфобилиногенсинтазой (PBGS), где действуют различные факторы, такие как pH и связывание лиганда. сообщается, что он влияет на активность ферментов и стабильность белка.
Мономер ПАУ (51,9 кДа) состоит из трех отдельных доменов: регуляторного N-концевого домена (остатки 1–117), который содержит Phe-связывающий субдомен ACT, каталитический домен (остатки 118–427) и C-концевой домен (остатки 428–453), ответственные за олигомеризацию идентичных мономеров. Был проведен обширный кристаллографический анализ, особенно каталитического домена, координированного птерином и железом, для исследования активного сайта. Также была определена структура N-концевого регуляторного домена, и вместе с решенной структурой гомологичного C-концевого домена тетрамеризации тирозингидроксилазы была предложена структурная модель тетрамерного PAH. С помощью рентгеновской кристаллографии структура полноразмерного ПАУ крысы была определена экспериментально и показала автоингибированную форму фермента или форму состояния покоя. Форма в состоянии покоя (RS-PAH) архитектурно отличается от активированной формы (A-PAH). Полноразмерная структура A-PAH в настоящее время отсутствует, но был определен стабилизированный Phe интерфейс ACT-ACT, который характерен для A-PAH, и была предложена структурная модель A-PAH, основанная на анализе SAXS.
Модель активного центра ПАУ, связанного с BH4, железом и аналогом фенилаланина. (из PDB 1KW0) Аналог фенилаланина, BH4, железо, Fe (II) -координированные остатки His и Glu Решенные кристаллические структуры каталитического домена показывают, что активный центр состоит из открытого и просторный карман, выстланный в основном гидрофобными остатками, хотя также присутствуют три остатка глутаминовой кислоты, два гистидина и тирозин, связывающий железо. Существуют противоречивые данные о состоянии координации атома двухвалентного железа и его близости к BH4 в активном центре. Согласно кристаллографическому анализу, Fe (II) координируется водой, His285, His290 и Glu330 (расположение лицевой триады 2-his-1-карбоксилата) с октаэдрической геометрией. Включение аналога Phe в кристаллическую структуру изменяет как железо из шести- в пятикоординированное состояние, включая одиночную молекулу воды, так и бидентатную координацию до Glu330 и открывая место для связывания кислорода. При этом BH4 смещается в сторону атома железа, хотя кофактор птерина остается во второй координационной сфере. С другой стороны, конкурирующая модель, основанная на анализе ЯМР и молекулярного моделирования, предполагает, что все скоординированные молекулы воды вытесняются из активного центра во время каталитического цикла, в то время как BH4 становится напрямую скоординированным с железом. Как обсуждалось выше, устранение этого несоответствия будет важно для определения точного механизма катализа ПАУ.
Регуляторная природа N-концевого домена (остатки 1–117) обеспечивается его структурной гибкостью. Анализ обменов водород / дейтерий показывает, что аллостерическое связывание Phe глобально изменяет конформацию ПАУ, так что активный центр менее закрывается, поскольку поверхность раздела между регуляторным и каталитическим доменами все больше подвергается воздействию растворителя. Это наблюдение согласуется с кинетическими исследованиями, которые показывают изначально низкую скорость образования тирозина для полноразмерных ПАУ. Однако это время задержки не наблюдается для усеченного PAH, лишенного N-концевого домена, или если полноразмерный фермент предварительно инкубируют с Phe. Удаление N-концевого домена также устраняет время задержки, увеличивая при этом сродство к Phe почти в два раза; не наблюдается различий в V max или K m для кофактора тетрагидробиоптерина. Дополнительное регулирование обеспечивается Ser16; фосфорилирование этого остатка не изменяет конформацию фермента, но снижает концентрацию Phe, необходимую для аллостерической активации. Этот N-концевой регуляторный домен не наблюдается в бактериальных ПАУ, но демонстрирует значительную структурную гомологию с регуляторным доменом фосфогилцератдегидрогеназы, фермента пути биосинтеза серина.
Прокариотический ПАУ является мономерный, тогда как эукариотический ПАУ существует в равновесии между гомотетрамерной и гомодимерной формами. Интерфейс димеризации состоит из петель, связанных с симметрией, которые связывают идентичные мономеры, в то время как перекрывающийся C-концевой домен тетрамеризации опосредует ассоциацию конформационно различных димеров, которые характеризуются различной относительной ориентацией каталитического и тетрамеризационного доменов (Flatmark, Erlandsen). Возникающее в результате искажение симметрии тетрамера проявляется в разной площади поверхности границ раздела димеризации и отличает ПАУ от тетрамерно-симметричной тирозингидроксилазы. Механизм обмена доменов был предложен для опосредования образования тетрамера из димеров, в котором С-концевые альфа-спирали взаимно изменяют свою конформацию вокруг гибкой С-концевой шарнирной области из пяти остатков, образуя структуру спиральной спирали, сдвигая равновесие. в сторону тетрамерной формы. Хотя как гомодимерные, так и гомотетрамерные формы ПАУ каталитически активны, они демонстрируют дифференциальную кинетику и регуляцию. Помимо пониженной каталитической эффективности, димер не проявляет положительной кооперативности по отношению к L-Phe (который при высоких концентрациях активирует фермент), что позволяет предположить, что L-Phe аллостерически регулирует PAH, влияя на взаимодействие димер-димер.
PAH является критическим ферментом в метаболизме фенилаланина и катализирует лимитирующую скорость стадию его полного катаболизма до диоксида углерода и воды. Регуляция потока через фенилаланин-ассоциированные пути имеет решающее значение для метаболизма млекопитающих, о чем свидетельствует токсичность высоких уровней этой аминокислоты в плазме, наблюдаемая при фенилкетонурии (см. Ниже). Основным источником фенилаланина являются белки, поступающие с пищей, но относительно небольшая часть этого пула используется для синтеза белка. Вместо этого большая часть принятого внутрь фенилаланина катаболизируется через ПАУ с образованием тирозина ; добавление гидроксильной группы позволяет разорвать бензольное кольцо на последующих катаболических стадиях. Трансаминирование в фенилпируват, метаболиты которого выводятся с мочой, представляет собой другой путь обмена фенилаланина, но преобладает катаболизм через ПАУ.
У людей этот фермент экспрессируется как в печени, так и в почках, и есть некоторые признаки того, что он может по-разному регулироваться в этих тканях. ПАУ необычен среди гидроксилаз ароматических аминокислот из-за его участия в катаболизме; тирозин и триптофангидроксилазы, с другой стороны, в первую очередь экспрессируются в центральной нервной системе и катализируют ограничивающие скорость этапы биосинтеза нейромедиаторов / гормонов.
Дефицит активности PAH из-за мутаций в PAH вызывает гиперфенилаланинемию (HPA), а когда уровень фенилаланина в крови повышается более чем в 20 раз по сравнению с нормальной концентрацией, нарушение обмена веществ фенилкетонурия (ФКУ) результаты. ФКУ является как генотипически, так и фенотипически гетерогенным: было идентифицировано более 300 различных патогенных вариантов, большинство из которых соответствуют миссенс-мутациям, которые отображаются в каталитическом домене. Когда когорта идентифицированных мутантов PAH экспрессировалась в рекомбинантных системах, ферменты демонстрировали измененное кинетическое поведение и / или пониженную стабильность, что согласуется со структурным картированием этих мутаций как в каталитическом, так и в тетрамеризационном доменах фермента. BH4 4 вводился в качестве фармакологического лечения, и было показано, что он снижает уровень фенилаланина в крови у части пациентов с ФКУ, генотипы которых приводят к некоторой остаточной активности ПАУ, но не имеют дефектов в BH4 4 синтез или регенерация. Последующие исследования показывают, что в случае некоторых мутантов ПАУ избыток BH4 4 действует как фармакологический шаперон для стабилизации мутантных ферментов с нарушенной сборкой тетрамера и повышенной чувствительностью к протеолитическому расщеплению и агрегации.. Мутации, которые были идентифицированы в локусе PAH, задокументированы в базе знаний по локусу фенилаланингидроксилазы (PAHdb, https://web.archive.org/web/20130718162051/http://www.pahdb.mcgill.ca/ ).
Поскольку фенилкетонурия может вызвать необратимый ущерб, крайне важно, чтобы дефицит фенилаланингидроксилазы определялся на ранней стадии развития. Первоначально это было сделано с использованием анализа ингибирования бактерий, известного как Тест Гатри. Сейчас ФКУ является частью скрининга новорожденных во многих странах, и повышенные уровни фенилаланина выявляются вскоре после рождения путем измерения с помощью тандемной масс-спектрометрии. Посадка человека на диету с низким содержанием фенилаланина и высоким содержанием тирозина может помочь предотвратить любые долгосрочные нарушения их развития.
Фенилаланингидроксилаза тесно связана с двумя другими ферментами:
Три фермента гомологичны, то есть считается, что они произошли от одной и той же древней гидроксилазы.
.. 