Ядерная обкатка

Для идентификации генов, которые транскрибируются в определенный момент времени, проводится повторный ядерный анализ. Приблизительно один миллион ядер клеток выделяют и инкубируют с мечеными нуклеотидами, а гены в процессе транскрибирования обнаруживают путем гибридизации извлеченной РНК с ген-специфическими зондами на блоте. Гарсия-Мартинес и др. (2004) разработали протокол для дрожжевых S. cerevisiae (Genomic run-on, GRO), который позволяет рассчитывать скорости транскрипции (TR) для всех генов дрожжей для оценки стабильности мРНК для всех мРНК дрожжей.

Недавно были разработаны альтернативные методы микроматрицы, в основном PolII RIP-чип: иммунопреципитация РНК РНК-полимеразы II с фосфорилированными антителами, направленными на С-концевой домен, и гибридизация на предметном стекле или чипе микроматрицы (слово «чип» в названии происходит от «ChIP-chip» где требовался специальный чип Affymetrix GeneChip). Сравнение методов, основанных на run-on и ChIP-chip, было проведено на дрожжах (Pelechano et al., 2009). Обнаружено общее соответствие обоих методов, но GRO является более чувствительным и количественным. Следует учитывать, что run-on выявляет только удлиняющиеся РНК-полимеразы, тогда как ChIP-chip обнаруживает все присутствующие РНК-полимеразы, в том числе и те, которые имеют обратный путь.

Обзор глобального исследования секвенирования для определения генов в масштабах всего генома, участвующих в транскрипции.

Присоединение новой РНК-полимеразы к генам предотвращается включением саркозила. Следовательно, только гены, которые уже имеют РНК-полимеразу, будут производить меченые транскрипты. Транскрипты РНК, которые были синтезированы до добавления метки, не будут обнаружены, поскольку в них не будет метки. Эти прогоны транскриптов также можно обнаружить путем очистки меченых транскриптов с использованием антител, которые обнаруживают метку, и гибридизации этих выделенных транскриптов с массивами экспрессии генов или путем секвенирования следующего поколения (GRO-Seq).

Анализы Run on были в значительной степени вытеснены Global Run анализами, в которых в качестве платформы для считывания используется секвенирование ДНК следующего поколения. Эти анализы известны как GRO-Seq и дают невероятно подробное представление о генах, участвующих в транскрипции, с количественными уровнями экспрессии. Методы на основе массивов для анализа анализов Global run on (GRO) заменяются секвенированием следующего поколения, которое исключает создание зондов против последовательностей генов. Секвенирование каталогизирует все полученные транскрипты, даже если они не указаны в базах данных. GRO-seq включает мечение вновь синтезированных транскриптов бромуридином (BrU). Клетки или ядра инкубируются с BrUTP в присутствии саркозила, который предотвращает прикрепление РНК-полимеразы к ДНК. Следовательно, только РНК-полимераза, которая уже присутствует в ДНК до добавления саркозила, будет производить новые транскрипты, которые будут помечены BrU. Меченые транскрипты захватываются гранулами, меченными анти-BrU антителами, превращаются в кДНК и затем секвенируются секвенированием ДНК следующего поколения. Затем считывания секвенирования выравниваются с геномом, и количество считываний на транскрипт обеспечивает точную оценку количества синтезированных транскриптов.