Войти
[NiFe] гидрогеназа представляет собой тип гидрогеназы, который является окислительным ферментом, который обратимо превращает молекулярный водород в прокариотах, включая Бактерии и Археи. Каталитический сайт на ферменте обеспечивает простые микроорганизмы, метаболизирующие водород; окислительно-восстановительный механизм, с помощью которого накапливается и используется энергия посредством реакции, показанной на рисунке 1. Это особенно важно для анаэробных сульфатредуцирующих бактерий этого рода. Desulfovibrio, а также патогенные организмы Escherichia coli и Helicobacter pylori. Механизмы созревания Активность и функция [NiFe] гидрогеназ активно исследуются для применения в водородной экономике и в качестве потенциальных мишеней для антибиотиков.
Рисунок 2 Структура D. vulgaris Miyazaki F состояла из двух субъединиц: большой субъединицы (синий) и малой субъединицы (пурпурный). Рисунок был подготовлен с использованием Jmol и координат из 1H2A.pdb. Структура [NiFe] гидрогеназы была получена из рентгеновской кристаллографии исследований пяти различных сульфатредуцирующих бактерий: D. vulgaris Miyazaki F, D. gigas, D. frutosovorans, D. desulfuricans и Desulfomicrobium baculatum. [NiFe] гидрогеназа, выделенная из D. vulgaris Miyazaki F, показана на рисунке 2. Большая субъединица выделена синим цветом, имеет молекулярную массу 62,5 кДа и содержит активный сайт Ni-Fe .. Меньшая субъединица имеет пурпурный цвет, имеет молекулярную массу 28,8 кДа и содержит кластеры Fe-S (см. кластер железо-сера ).
Фиг. 3. Активный центр [NiFe] гидрогеназы в окисленной форме. L относится к небелковому лиганду (1 C≡O и 2 C≡N). X может быть оксидом, серой, гидропероксидом или гидроксидом.Из инфракрасных спектров и Исследования рентгеновской кристаллографии показали, что активный центр [NiFe] гидрогеназы представляет собой (S-Cys) 4 Ni (μ-X) Fe (CO) (CN) 2, в котором общий лиганд X представляет собой либо оксид, серы, гидропероксид, или гидроксид, обнаруженный в только окисленное состояние (рис. 3). В то время как атом никеля участвует в окислительно-восстановительных реакциях, атом железа постоянно находится в координационном состоянии Fe (II). Точная геометрия трех небелковых лигандов (обозначенных L), координирующих координацию с ионом металла Fe, неизвестна; однако они были идентифицированы как одна молекула окиси углерода (C≡O) и две молекулы цианида (C≡N).
Почти все гидрогеназы содержат по крайней мере один железо-серный кластер (Fe-S кластер). Как упоминалось ранее, эти кластеры Fe-S соединяют никелевый активный центр фермента с поверхностью белка, поскольку они служат в качестве цепи переноса электронов от окислительно-восстановительного центра Ni-Fe к акцептору электронов цитохрому c 3 (см. Семейство цитохрома c ). Эти электроны образуются в результате гетеролитического расщепления молекулы водорода в активном центре Ni-Fe. Кристаллические структуры гидрогеназы показывают Fe 3S4в центре цепи и кластер Fe 4S4на молекулярной поверхности. Расстояние между внутренним кластером Fe 4S4и активным центром составляет примерно 12 Å (Рисунок 4).
Гидрогеназы [NiFe] и [NiFeSe] имеют удивительно похожие структуры, что позволяет предположить, что одна сера на кластере Fe-S был заменен атомом селена, но эти гидрогеназы различаются по каталитической реакционной способности и чувствительности к ингибиторам фермента.
Рис. 4. Иллюстрация фермента [NiFe] гидрогеназы с тремя Fe -S кластеры в малой субъединице с активным центром диметалла Mg и Ni-Fe в большой субъединице. Рисунок был подготовлен с использованием Jmol и координат из 1H2A.pdb. Mg ion = неоново-зеленый; Ион Ni = темно-зеленый; Ион Fe = оранжевый; сера = желтый; кислород = красный; углерод = темно-серый [NiFe] гидрогеназа имеет катион Mg, связанный в области С-конца большей субъединицы. Этот катион связан с тремя молекулами воды и тремя аминокислотами, и он стабилизирует эту свободную от растворителя область. Находясь примерно в 13 Å от фрагмента [NiFe], этот катион соединяет активный сайт с сетью водородных связей и служит в качестве пути переноса протона (H).
Исследования, в которых ксенон был связан с гидрогеназой, предполагают гидрофобный газовый канал, через который H 2, Газы CO и O 2 могут достигать глубоко скрытого активного центра внутри фермента. Кристаллическая структура выявила несколько небольших каналов на поверхности, которые объединились в один более крупный канал, который достиг активного центра [Ni-Fe].
Так как хорошо известно, что гидрогеназы чувствительны к кислороду, диффузия газа к активному центру зависит от размера и окружающей среды канала доступа к газу, реакции молекулярного кислорода (O 2) в активном центре и восстановления активного центра после окисления.
Точный механизм реакции [NiFe] гидрогеназ был предметом больших споров. В 2009 году Хигучи и его коллеги предложили механизм, основанный на рентгеновской кристаллографии и спектроскопических данных Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F. Во время каталитического процесса ион металла Fe в активном центре не меняет свою степень окисления в то время как ион металла Ni участвует в окислительно-восстановительной химии. Есть две основные группы окислительно-восстановительных состояний, через которые [NiFe] гидрогеназы проходят во время катализа: 1) неактивные окислительно-восстановительные состояния и 2) активные окислительно-восстановительные состояния (рис. 5).
Фиг. 5. Различные окислительно-восстановительные состояния металлического активного центра [NiFe] гидрогеназы. Красный цвет - это неактивные окислительно-восстановительные состояния . Окислительно-восстановительные состояния, отмеченные зеленым цветом, - это активные окислительно-восстановительные состояния . (Адаптировано из статьи 11). Ni-A (состояние «неготовность») и Ni-B (состояние «готовность») являются наиболее распространенными. окисленные формы металлического центра [NiFe] и активируются посредством одноэлектронного восстановления с переносом протона. Скорость восстановительной активации от Ni-A до Ni-SU может занять несколько часов, в то время как скорость восстановительной активации от Ni-B до Ni- SIr происходит за секунды. Причина этого несоответствия в кинетике активации между Ni-A и Ni-B была предложена как результат разницы в мостиковых лигандах между двумя разными окислительно-восстановительными состояниями. В состоянии Ni-SIr молекула воды высвобождалась с образованием состояния Ni-SIa, первого каталитического окислительно-восстановительного активного состояния [NiFe] гидрогеназ.
Три наиболее важных каталитических окислительно-восстановительных активных состояния [NiFe] гидрогеназ - это Ni-SIa, Ni-C и Ni-R (есть три разных варианта :). Светочувствительное состояние Ni-C может быть получено посредством восстановления одним электроном Ni-SIa . Спектроскопические исследования электронного парамагнитного резонанса состояния Ni-C, которое содержит Ni с S = 1/2 (см. Spin-1/2 ) и гидрид, соединяющий два металла Ni и Fe, показал, что гетеролитическое расщепление H 2 происходит в активном центре [NiFe] гидрогеназы.
Состояние Ni-SIa могут быть ингибированы с помощью CO, который непосредственно связывается с ионом металла Ni в изогнутой конформации с образованием Ni-SCO ( Смотри ниже). Поскольку Ni-C является светочувствительным, при освещении при 100К возникает окислительно-восстановительное состояние Ni-L . В присутствии CO Ni-L образует Ni-CO состояние.
Фигура 6. Иллюстрация активного сайта [NiFe] гидрогеназы, ингибируемого CO. Вид сверху вниз (слева). Вид сбоку (в центре). Изображение ингибированного активного сайта Chemdraw (справа). Рисунок был подготовлен с помощью Jmol и координаты из 1UBK.pdb. Ион Ni = зеленый; Ион Fe = оранжевый; сера = желтый; кислород = красный; углерод = темно-серый; азот = синий. Созревание [NiFe] гидрогеназ требует набора дополнительных белков, которые синтезируют активный сайт NiFe, рис. 2, и модифицируют фермент-предшественник, чтобы он имел правильная структура и расположение. Созревание активного центра представляет особый интерес из-за синтеза металлических лигандов цианида (CN) и монооксида углерода (CO), которые обычно токсичны для живых организмов. Этот шаг завершается белками HypC, HypD, HypE и HypF. После синтеза железного центра никель вводят с использованием металло-шаперонов HypA, HypB и SlyD. Как только каталитический центр завершен, предшественник гидрогеназы подвергается C-концевому расщеплению, что вызывает перестройку его структуры и ассоциацию с небольшой субъединицей. Наконец, готовый фермент транспортируется в правильное положение внутри клетки. Промотор гидрогеназы, P SH, может быть изучен путем конструирования слияния P SH промотор-gfp с использованием зеленого флуоресцентного белка (gfp) репортерный ген.
Поскольку [NiFe] гидрогеназа является членом семейства гидрогеназ, эти ферменты могут катализировать как потребление, так и производство водорода. Изучая [NiFe] гидрогеназу, ученые могут оптимизировать условия, при которых белок будет производить только водород. Кроме того, небольшой фермент, имитирующий [NiFe] гидрогеназу, также может быть синтезирован в качестве генератора газообразного водорода. Растворимая [NiFe] гидрогеназа из Ralstonia eutropha H16 является многообещающим ферментом-кандидатом для применения в биотопливе на основе H 2, поскольку она способствует окислению H 2 и является относительно кислородом. -толерантный. Его можно получить на гетеротрофной питательной среде и очистить с помощью матриц анионообменной и эксклюзионной хроматографии.
