Войти
Наноразмерная масс-спектрометрия вторичных ионов (nanoSIMS ) - это аналитический метод, используемый для сбора измерения элементного и изотопного состава материала с наномасштабным разрешением с использованием секторного масс-спектрометра. Этот прибор основан на масс-спектрометрии вторичных ионов. NanoSIMS может создавать наноразмерные карты элементного состава, параллельное получение семи масс, изотопную идентификацию, сочетая высокое разрешение по массе, частей на миллион чувствительность обычной SIMS с пространственным разрешением до 50 нм и быстрое получение.
Упрощенная схема прибора NanoSims50. NanoSIMS относится не только к используемому методу, но и к масс-спектрометру, специализированному для этого метода. Оригинальный дизайн прибора был разработан Жоржем Слодзианом из Университета Париж-Юг во Франции. В настоящее время в мире существует более 40 приборов NanoSIMS.
Как правило, NanoSIMS использует ионную пушку для создания первичного пучка ионов. Эти первичные ионы разрушают поверхность образца и вызывают атомные столкновения, некоторые из которых приводят к высвобождению вторичных ионных частиц. Эти ионы передаются через масс-спектрометр, где измеряются и идентифицируются массы. Первичный ионный пучок может растрироваться по образцу и создавать «карту» распределения элементов и изотопов путем подсчета количества ионов, которые возникли из каждой точки, с разрешением до 50 нанометров (нм), что в 10-50 раз больше, чем у обычных SIMS. Это достигается за счет размещения первичного зонда в непосредственной близости от образца. Пучок первичных ионов воздействует на поверхность образца под углом 90 °, а вторичные ионы выводятся обратно через ту же линзу, что позволяет различать изотопный состав отдельных ячеек в частях на миллион (ppm) или частях на миллиард (ppb). диапазон.
NanoSIMS может обнаруживать мельчайшие различия масс между ионами с разрешением M / dM>5000, где M - номинальная масса изотопа, а dM - разность масс между интересующими изотопами. Возможности NanoSIMS с высоким разрешением по массе позволяют идентифицировать и наносить на карту различные элементы и их изотопы в образце, даже если они очень близки по массе. Масс-спектрометр способен к мультиколлекции, то есть до 5 (NanoSIMS 50) или 7 (NanoSIMS 50 L) масс могут быть одновременно обнаружены, от водорода до урана, хотя и с ограничениями. Относительно большое количество масс помогает устранить ошибки измерения, так как предотвращаются возможные изменения в условиях прибора или образца, которые могут возникнуть между прогонами.
Ионный пучок должен быть настроен на обнаружение отрицательных или положительных ионов, что обычно выполняется с помощью с использованием пучка Cesium + или Oxygen- соответственно. Это высокое массовое разрешение особенно актуально для биологических приложений. Например, азот - один из самых распространенных элементов в организмах. Однако из-за низкого сродства атома азота к электрону образование вторичных ионов происходит редко. Вместо этого можно генерировать и измерять такие молекулы, как CN. Однако из-за комбинаций изотопов (таких как изобары CN- и CN-) будут генерироваться почти идентичные молекулярные массы 27000 и 27,006 дальтон соответственно. В отличие от других методов визуализации, где CN и CN невозможно измерить независимо из-за почти одинаковых масс, NanoSIMS может безопасно различать различия между этими молекулами.
Масс-спектрометр с магнитным сектором вызывает физическое разделение ионов с другим отношением массы к заряду. Физическое разделение вторичных ионов вызывается силой Лоренца, когда ионы проходят через магнитное поле, перпендикулярное вектору скорости вторичных ионов. Сила Лоренца утверждает, что частица будет испытывать силу
![\ mathbf {F} = q \ left [\ mathbf {E} + ( \ mathbf {v} \ times \ mathbf {B}) \ right]](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/f0139e901d2aa4f20d3deb80a4e6dd56cd3321a6)
, когда он сохраняет заряд q и проходит через электрическое поле E и магнитное поле B со скоростью v . Вторичные ионы, которые покидают поверхность образца, обычно имеют кинетическую энергию в несколько электрон-вольт (эВ), хотя было обнаружено, что довольно небольшая часть имеет энергию в несколько кэВ. Электростатическое поле захватывает вторичные ионы, покидающие поверхность образца; эти извлеченные ионы затем переносятся в масс-спектрометр. Для достижения точных измерений изотопа необходимы высокое пропускание и высокое разрешение по массе. Высокое пропускание означает низкие потери вторичных ионов между поверхностью образца и детектором, а высокое разрешение по массе относится к способности эффективно отделять вторичные ионы (или представляющие интерес молекулы) от других ионов и / или ионов схожей массы. Первичные ионы будут сталкиваться с поверхностью с определенной частотой на единицу площади поверхности. В результате столкновения атомы разбрызгиваются с поверхности образца, и лишь небольшая часть этих атомов подвергнется ионизации. Они становятся вторичными ионами, которые затем обнаруживаются после передачи через масс-спектрометр. Каждый первичный ион генерирует некоторое количество вторичных ионов изотопа, которые достигают детектора для подсчета. Скорость счета определяется как
где I (M) - это скорость счета изотопа M элемента M. Скорость счета изотопа зависит от концентрации X M и изотопного содержания элемента, обозначенного A я. Поскольку первичный ионный пучок определяет вторичные ионы Y, которые распыляются, плотность первичного ионного пучка, d b, которая определяется как количество ионов в секунду на единицу площади поверхности, будет воздействуют на часть площади поверхности образца S с равномерным распределением первичных ионов. Из распыленных вторичных ионов только часть будет ионизирована, Y i. Вероятность того, что любой ион будет успешно перенесен от масс-спектрометра к детектору, равна T. Произведение Y i и T определяет количество изотопов, которые будут ионизированы, а также обнаружены, поэтому он считается полезный урожай.
Одним из наиболее важных шагов при использовании NanoSIMS является подготовка образца. Для отдельных экспериментов следует разработать специальные протоколы, чтобы наилучшим образом сохранить истинное пространственное распределение и количество молекул на основе образца. Как правило, из-за конструкции машины NanoSIMS образец должен быть совместимым с вакуумом (т. Е. Не содержать летучих веществ), плоским, что уменьшает изменение траекторий ионизации, и проводящим, что может быть выполнено напылением с использованием Au, Ir или C. Биологические образцы, такие как клетки или ткани, можно зафиксировать и внедрить в смолу перед разделением на срезы по 100 нм и поместить на силиконовые чипы или слайды перед просмотром.
NanoSIMS может захватывать пространственная изменчивость изотопных и элементных измерений субмикронных областей, зерен или включений из геологических и биологических образцов. Этот прибор может характеризовать наноструктурированные материалы сложного состава, которые становятся все более важными кандидатами для генерации и хранения энергии.
NanoSIMS впервые была использована в ЭТОМ ИССЛЕДОВАНИИ.
NanoSIMS также оказался полезным при изучении космохимических проблем, когда были приготовлены образцы единичных, микро- или субмикронных зерен из метеоритов, а также срезы микротома с помощью метода сфокусированного ионного пучка (FIB) может быть проанализирован. NanoSIMS можно комбинировать с просвечивающей электронной микроскопией (TEM) при использовании микротома или срезов FIB. Эта комбинация позволяет проводить коррелированные минералогические и изотопные исследования на месте в субмикрометровом масштабе.
Он особенно полезен при исследовании материалов из-за его высокой чувствительности при высоком разрешении по массе, что позволяет получать изображения и количественный анализ микроэлементов.
Первоначально разработан для геохимических исследований. и связанных с ним исследований, NanoSIMS теперь используется в самых разных областях, включая биологию и микробиологию. В биомедицинских исследованиях NanoSIMS также называют масс-спектрометрией с мультиизотопной визуализацией (MIMS). Разрешение 50 нм обеспечивает беспрецедентное разрешение клеточных и субклеточных характеристик (для сравнения, модельный организм E. coli обычно имеет диаметр от 1000 до 2000 нм). Высокое разрешение, которое он предлагает, позволяет внутриклеточно измерять скопления и потоки молекул, содержащих различные стабильные изотопы. NanoSIMS можно использовать для чистых культур, совместных культур и образцов смешанных сообществ.
Впервые NanoSIMS в биологии использовали Петерандерл и Лечен в 2004 году, которые использовали прототип NanoSIMS для исследования и измерения углерода и изотопы азота эукариотических клеток. Это исследование было первым случаем, когда отношения изотопов углерода и азота были непосредственно измерены в субклеточном масштабе в биологическом образце.
Другие методы микроскопии обычно используются в тандеме с NanoSIMS, что позволяет получать несколько типов информации (например, таксономическую информацию с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) или идентификацию дополнительных физиологических особенностей с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ)) будет предоставлено.
Традиционные методы, которые используются для мечения и идентификации субклеточных свойств клеток, такие как мечение иммунным золотом, также можно использовать с анализом NanoSIMS. Маркировка Immunogold использует антитела для нацеливания на определенные белки, а затем маркирует антитела наночастицами золота. Инструмент NanoSIMS может обнаруживать частицы золота, обеспечивая местоположение меченых белков с высоким разрешением. Золотосодержащие или платиносодержащие соединения, используемые в качестве противораковых препаратов, были визуализированы с помощью NanoSIMS для изучения субклеточного распределения в клетках рака молочной железы и рака толстой кишки соответственно. В отдельном исследовании было изучено связывание антитела с антигеном без необходимости добавления флуоресцентной метки к антителу, что позволило провести локализацию без метки и провести количественный анализ с высоким разрешением.
Анализ NanoSIMS диатомовых водорослей и бактерий (белая стрелка) с использованием стабильного изотопа, меченного нитратом азота. На панелях а-е темно-синий цвет представляет низкие количества каждого изотопа, а желтый - высокие количества. Бактерии, но не диатомовые водоросли, включали тяжелый азот, как видно на панели c. Естественное отношение N к N составляет 0,04. Любое соотношение выше этого указывает, что организм включил нитрат азота в свое органическое вещество. Также можно увидеть естественные различия в содержании S между бактериями и диатомовыми водорослями (панель d), а также сигнал Si створки диатомовой водоросли, состоящей из кремнезема (панель e). Панель f представляет собой флуоресценцию той же диатомовой водоросли. Красное поле указывает на тот же вид, что и на панелях a-e. Каждое изображение nanoSIMS имеет размер 50 мкм на 50 мкм. Изображение предоставлено Международным учебным курсом по геобиологии и лабораторией для сирот, Калифорнийский технологический институт. Другой распространенный метод, обычно используемый в анализе NanoSIMS, - это зондирование стабильных изотопов. Этот метод включает введение стабильных изотопно меченных биологически значимых соединений организмы для потребления и интеграции в органическое вещество. При анализе с помощью NanoSIMS этот метод называется nanoSIP. NanoSIMS можно использовать для определения того, какие организмы включили какие молекулы, сколько меченых молекул было включено полуколичественным способом и где в клетке произошло включение. Предыдущие методы количественного анализа с более низким разрешением, чем NanoSIMS, стабильных меченых изотопами молекул были ограничены анализируемым объемным материалом, что не позволяло получить представление о вкладе отдельных клеток или субклеточных компартментов. Кроме того, удаление крупных чужеродных молекул (таких как антитела или частицы золота) из экспериментальной установки снимает опасения, что меченые молекулы, необходимые для других методов микроскопии, могут иметь биохимические реакции или свойства, отличные от обычных.
Этот метод можно использовать для изучения обмена питательных веществ. Микробиом кишечника мыши исследовали, чтобы определить, какие микробы питаются соединениями, производными от хозяина. Для этого мышам давали корм, обогащенный стабильными изотопно-меченными аминокислотами, и исследовали микробную биомассу. NanoSIMS позволяет исследовать метаболический вклад отдельных микробов. NanoSIMS был использован для изучения и впервые доказательств способности бактерий и архей фиксировать азот из глубин океана путем подачи азотсодержащих соединений в образцы донных отложений. NanoSIMS также можно использовать для оценки скорости роста организмов, поскольку количество углерода или другого субстрата, накопленного внутри клетки, позволяет оценить, сколько биомассы вырабатывается.
Органический материал, естественно, содержит стабильные изотопы в различных соотношениях в окружающей среде, что может предоставить информацию о происхождении источника пищи для организмов. Различные типы органических материалов источников пищи имеют разное количество стабильных изотопов, что отражается на составе организма, который потребляет эти источники пищи. Этот тип анализа был впервые использован в 2001 году совместно с FISH для изучения синтрофических отношений между анаэробными метанокисляющими археями и сульфатредуцирующими бактериями. Изотопы с низким естественным содержанием могут быть не обнаружены этим методом.
NanoSIMS также может использоваться для изучения элементного и изотопного состава микрочастиц, сохранившихся в летописи горных пород. Типы элементов и изотопные отношения могут помочь определить, имеет ли материал биологическое происхождение. NanoSIMS был впервые использован в этой области палеобиологии в 2005 году Робертом и др. В этом исследовании было обнаружено, что микрофоссилии содержат элементы углерода, азота и серы, расположенные в виде «глобул», напоминающих клеточные стенки. Измеренное отношение углерода к азоту также служило индикатором биологического происхождения, поскольку порода, окружающая окаменелости, имела очень разные отношения C к N.
