Войти
Принцип технологии MST: MST выполняется в тонких капиллярах в свободном растворе, что обеспечивает условия, близкие к нативным (без иммобилизации в любом буфере, даже в сложных биожидкостях), и инструмент, не требующий обслуживания. При выполнении эксперимента MST инфракрасный лазер индуцирует микроскопический температурный градиент, и обнаруживают TRIC, а также термофорез. TRIC зависит от микросреды флуорофора, которая обычно изменяется в событиях связывания. Термофорез, движение молекулы в температурном градиенте, зависит от трех параметров, которые обычно меняются при взаимодействии. Таким образом, общий сигнал MST наносится на график зависимости от концентрации лиганда для получения кривой доза-ответ, из которой можно вывести аффинность связывания. Термофорез на микромасштабах (MST ) - это технология для биофизический анализ взаимодействий между биомолекулами. Микромасштаб термофорез основан на обнаружении вызванного температурой изменения флуоресценции мишени как функции концентрации нефлуоресцентного лиганда. Наблюдаемое изменение флуоресценции основано на двух различных эффектах. С одной стороны, он основан на изменении интенсивности, зависящей от температуры (TRIC) флуоресцентного зонда, на которое могут влиять события связывания. С другой стороны, он основан на термофорезе, направленном движении частиц в микроскопическом температурном градиенте. Любое изменение химического микроокружения флуоресцентного зонда, а также изменения в гидратной оболочке биомолекул приводят к относительному изменению флуоресценции, обнаруживаемой при применении градиента температуры, и могут использоваться для определения сродство связывания. MST позволяет измерять взаимодействия непосредственно в растворе без необходимости иммобилизации на поверхности (технология без иммобилизации).
MST использовался для оценки вкладов энтальпии и энтропии в биомолекулярные взаимодействия.
MST основывается на количественной оценке обнаружение изменения флуоресценции в образце при изменении температуры. Флуоресценция целевой молекулы может быть внешней или внутренней (ароматические аминокислоты ) и изменяется в зависимости от температурных градиентов из-за двух различных эффектов. С одной стороны, изменение интенсивности, связанное с температурой (TRIC), которое описывает внутреннее свойство флуорофоров изменять интенсивность их флуоресценции в зависимости от температуры. На степень изменения интенсивности флуоресценции влияет химическая среда флуоресцентного зонда, которая может изменяться в событиях связывания из-за конформационных изменений или близости лигандов. С другой стороны, MST также основан на направленном движении молекул по температурным градиентам, эффект, называемый термофорезом. Пространственная разность температур ΔT приводит к изменению концентрации молекул в области повышенной температуры, количественно определяемой коэффициентом Соре S T:cгорячий / c холодный = exp (-S T ΔT). И TRIC, и термофорез вносят вклад в регистрируемый сигнал при измерениях MST следующим образом: ∂ / ∂T (cF) = c∂F / ∂T + F∂c / ∂T. Первый член в этом уравнении c∂F / ∂T описывает TRIC как изменение интенсивности флуоресценции (F) как функцию температуры (T), тогда как второй член F∂c / ∂T описывает термофорез как изменение концентрации частиц (c) как функция температуры. Термофорез зависит от границы раздела между молекулой и растворителем. В условиях постоянного буфера термофорез исследует размер, заряд и энтропию сольватации молекул. Термофорез флуоресцентно меченой молекулы A обычно значительно отличается от термофореза комплекса молекула-мишень AT из-за различий в размере, заряде и энтропии сольватации. Эта разница в термофорезе молекул используется для количественной оценки связывания в экспериментах по титрованию при постоянных условиях буфера.
Термофоретическое движение флуоресцентно меченой молекулы измеряется путем отслеживания распределения флуоресценции F внутри капилляра. Микроскопический температурный градиент создается ИК-лазером, который фокусируется в капилляре и сильно поглощается водой. Температура водного раствора в лазерном пятне повышается на ΔT = 1-10 К. Перед включением ИК-лазера внутри капилляра наблюдается однородное распределение флуоресценции F холодный. Когда ИК-лазер включен, в одном и том же временном интервале возникают два эффекта, которые вносят вклад в новое распределение флуоресценции F hot. Термическая релаксация вызывает зависящее от связывания падение флуоресценции красителя из-за его локальной реакции, зависящей от окружающей среды, на скачок температуры (TRIC). В то же время молекулы обычно перемещаются из области локального нагрева во внешние холодные области. Локальная концентрация молекул уменьшается в нагретой области до достижения стационарного распределения.
В то время как масса диффузия D определяет кинетику истощения, S T определяет коэффициент стационарной концентрации c hot / c холод = exp (-S T ΔT) ≈ 1-S T ΔT при повышении температуры ΔT. Нормализованная флуоресценция F norm = F hot / F cold измеряет в основном это соотношение концентраций в дополнение к TRIC ∂F / ∂T. В линейном приближении находим: F norm = 1 + (∂F / ∂T-S T) ΔT. Благодаря линейности интенсивности флуоресценции и термофоретического истощения, нормализованная флуоресценция несвязанной молекулы F norm (A) и связанного комплекса F norm (AT) линейно накладываются. Обозначая x долю молекул, связанных с мишенями, изменяющийся сигнал флуоресценции во время титрования мишени T определяется следующим образом: F norm = (1-x) F norm (A) + x F norm (AT).
Количественные параметры связывания получают с использованием серийного разведения связывающего субстрата. Построив F norm против логарифма различных концентраций серии разведений, получают сигмоидальную кривую связывания. Эта кривая связывания может быть напрямую подогнана к нелинейному решению закона действия масс, с получением константы диссоциации K D.
