Войти
A микросателлит - это участок повторяющейся ДНК, в котором определенные мотивы ДНК ( длина от одной до шести или более пар оснований ) повторяется, как правило, 5–50 раз. Микросателлиты встречаются в тысячах мест в геноме организма. У них более высокая частота мутаций , чем в других областях ДНК, что приводит к высокому генетическому разнообразию. Микросателлиты часто называются короткими тандемными повторами (STR ) судебными генетиками и в генетической генеалогии или простыми генетики растений повторяют последовательность (SSR ).
Микросателлиты и их более длинные родственники, минисателлиты вместе классифицируются как VNTR (переменное количество тандемных повторов ) ДНК. Название «сателлитная» ДНК относится к раннему наблюдению, что центрифугирование геномной ДНК в пробирке отделяет заметный слой основной ДНК от сопутствующих «спутниковых» слоев повторяющейся ДНК.
Они широко используются для профилирования ДНК в диагностике рака, в анализе родства (особенно проверки отцовства ) и в судебно-медицинской идентификации. Они также используются в анализе генетической связи для определения местоположения гена или мутации, ответственных за данный признак или заболевание. Микросателлиты также используются в популяционной генетике для измерения уровней родства между подвидами, группами и индивидуумами.
Хотя первый микроспутник был описан в 1984 году в Университете Лестера Веллера, Джеффриса и его коллег в качестве полиморфного повтора GGAT в гене миоглобина человека термин «микросателлит» был введен позже, в 1989 году, Литт и Льюти. Название «сателлитная» ДНК относится к раннему наблюдению, что центрифугирование геномной ДНК в пробирке отделяет заметный слой основной ДНК от сопутствующих «спутниковых» слоев повторяющейся ДНК. Растущая доступность амплификации ДНК с помощью ПЦР в начале 1990-х годов вызвала большое количество исследований с использованием амплификации микросателлитов в качестве генетических маркеров для судебной медицины, для проверки отцовства и для позиционного клонирования для поиска гена, лежащего в основе признака или заболевания. Известные ранние применения включают идентификацию с помощью микросателлитного генотипирования восьмилетних скелетных останков британской жертвы убийства (Hagelberg et al. 1991) и врача концлагеря Освенцим Йозефа Менгеле, сбежавшего на юг. Америка после Второй мировой войны (Джеффрис и др., 1992).
Микросателлит - это участок тандемно повторяющихся (т.е. смежных) мотивов ДНК, длина которых варьируется от от одного до шести или до десяти нуклеотидов (точное определение и определение более длинных минисателлитов варьируется от автора к автору) и обычно повторяются 5–50 раз. Например, последовательность TATATATATA представляет собой динуклеотидный микросателлит, а GTCGTCGTCGTCGTC представляет собой тринуклеотидный микросателлит (где A означает аденин, G гуанин, C цитозин и T Тимин ). Повторяющиеся единицы из четырех и пяти нуклеотидов называются тетра- и пентануклеотидными мотивами соответственно. У большинства эукариот есть микросателлиты, за заметным исключением некоторых видов дрожжей. Микросателлиты распределены по всему геному. Например, геном человека содержит 50 000–100 000 динуклеотидных микросателлитов и меньшее количество три-, тетра- и пентануклеотидных микросателлитов. Многие из них расположены в некодирующих частях генома человека и поэтому не продуцируют белки, но они также могут располагаться в регуляторных областях, а кодирующие области.
Микросателлиты в некодирующих областях могут не иметь какой-либо конкретной функции, и поэтому не может быть выбран против; это позволяет им беспрепятственно накапливать мутации из поколения в поколение и приводит к изменчивости, которая может использоваться для снятия отпечатков пальцев и идентификации ДНК. Другие микросателлиты расположены в регуляторных фланкирующих или интронных областях генов или непосредственно в кодонах генов - микросателлитные мутации в таких случаях могут приводить к фенотипическим изменениям и заболеваниям, особенно к болезням распространения триплетов, таким как хрупкий X-синдром и болезнь Хантингтона.
теломеры на концах хромосом, которые, как считается, участвуют в старении / старении, состоят из повторяющейся ДНК с гексануклеотидным повторяющимся мотивом TTAGGG у позвоночных. Таким образом, они классифицируются как миниспутники. Точно так же у насекомых есть более короткие повторяющиеся мотивы в своих теломерах, которые, возможно, можно рассматривать как микросателлиты.
Проскальзывание цепи ДНК во время репликации STR-локуса. Коробки символизируют повторяющиеся единицы ДНК. Стрелки указывают направление, в котором новая цепь ДНК (белые прямоугольники) реплицируется из цепи-шаблона (черные прямоугольники). Изображены три ситуации во время репликации ДНК. (a) Репликация STR-локуса прошла без мутации. (b) Репликация STR-локуса привела к увеличению на одну единицу из-за петли в новой цепи; аберрантная петля стабилизируется фланкирующими звеньями, комплементарными противоположной цепи. (c) Репликация STR-локуса привела к потере одной единицы из-за петли в цепи-шаблоне. (Forster et al. 2015) В отличие от точечных мутаций, которые затрагивают только один нуклеотид, микросателлитные мутации приводят к усилению или потере целой повторяющейся единицы, а иногда и к двум или более повторам одновременно. Таким образом, ожидается, что частота мутаций в микросателлитных локусах будет отличаться от скорости других мутаций, таких как частота замен оснований. Фактическая причина мутаций в микросателлитах обсуждается.
Одной из предполагаемых причин таких изменений длины является проскальзывание репликации, вызванное несоответствием между цепями ДНК при репликации во время мейоза. ДНК-полимераза, фермент, ответственный за считывание ДНК во время репликации, может скользить во время двигаясь вдоль цепочки шаблона и продолжая на неправильном нуклеотиде. Проскальзывание ДНК-полимеразы более вероятно при репликации повторяющейся последовательности (такой как CGCGCG). Поскольку микросателлиты состоят из таких повторяющихся последовательностей, ДНК-полимераза может делать ошибки с большей скоростью в этих областях последовательностей. Несколько исследований обнаружили доказательства того, что проскальзывание является причиной микросателлитных мутаций. Обычно проскальзывание каждого микроспутника происходит примерно раз в 1000 поколений. Таким образом, изменения проскальзывания в повторяющейся ДНК на три порядка более распространены, чем точечные мутации в других частях генома. Большая часть проскальзывания приводит к замене только одной повторяющейся единицы, а скорость проскальзывания варьируется для разных длин аллелей и размеров повторяющихся единиц, а также в пределах разных видов. Если существует большая разница в размерах между отдельными аллелями, то может иметь место повышенная нестабильность во время рекомбинации в мейозе.
Другой возможной причиной микросателлитных мутаций являются точечные мутации, когда только один нуклеотид неправильно копируется во время репликации. Исследование, сравнивающее геномы человека и приматов, показало, что большинство изменений в количестве повторов в коротких микросателлитах происходит из-за точечных мутаций, а не проскальзывания.
Частота мутаций микросателлитов зависит от положения основания относительно микросателлит, тип повтора и базовая идентичность. Частота мутации повышается с увеличением числа повторов, достигая пика примерно от шести до восьми повторов, а затем снова снижаясь. Повышенная гетерозиготность в популяции также увеличит частоту микросателлитных мутаций, особенно когда существует большая разница в длине между аллелями. Вероятно, это связано с гомологичными хромосомами с плечами неравной длины, вызывающими нестабильность во время мейоза.
Прямые оценки частоты микросателлитных мутаций были сделаны у многих организмов, от насекомых до людей. У пустынной саранчи Schistocerca gregaria частота микросателлитных мутаций оценивается в 2,1 x 10 на поколение на локус. Частота микросателлитных мутаций в мужских зародышевых линиях человека в пять-шесть раз выше, чем в женских зародышевых линиях, и колеблется от 0 до 7 x 10 на локус на гамету на поколение. У нематоды Pristionchus pacificus расчетная частота микросателлитных мутаций колеблется от 8,9 × 10 до 7,5 × 10 на локус на поколение.
Многие микросателлиты расположены в некодирующей ДНК и биологически молчаливы. Другие находятся в регуляторной или даже кодирующей ДНК - микросателлитные мутации в таких случаях могут привести к фенотипическим изменениям и заболеваниям. По оценкам полногеномного исследования, микросателлитные вариации вносят вклад в 10–15% наследственных вариаций экспрессии генов у людей.
У млекопитающих от 20% до 40% белков содержат повторяющиеся последовательности аминокислот, кодируемых повторами коротких последовательностей. Большинство повторов коротких последовательностей в кодирующих белки частях генома имеют повторяющуюся единицу из трех нуклеотидов, поскольку такая длина не вызывает сдвигов рамки считывания при мутации. Каждая повторяющаяся последовательность тринуклеотида транскрибируется в повторяющуюся серию одной и той же аминокислоты. В дрожжах наиболее распространенными повторяющимися аминокислотами являются глутамин, глутаминовая кислота, аспарагин, аспарагиновая кислота и серин.
Мутации в этих повторяющихся сегментах могут влиять на физические и химические свойства белков, что может привести к постепенным и предсказуемым изменениям в действии белков. Например, изменения длины в тандемно повторяющихся областях в гене Runx2 приводят к различиям в длине морды у домашних собак (Canis knownis) с ассоциацией между большей длиной последовательности и более длинной мордой. Эта ассоциация также применима к более широкому кругу видов Carnivora. Изменения длины полиаланиновых трактов в гене HoxA13 связаны с синдромом ладонно-стопно-генитального, нарушением развития человека. Изменения длины в других триплетных повторах связаны с более чем 40 неврологическими заболеваниями у людей, в частности болезнями разрастания триплетов, такими как синдром ломкой Х-хромосомы и болезнь Хантингтона. Эволюционные изменения из-за проскальзывания репликации также происходят в более простых организмах. Например, изменения длины микросателлитов обычны для белков поверхностных мембран у дрожжей, обеспечивая быструю эволюцию свойств клеток. В частности, изменения длины гена FLO1 контролируют уровень адгезии к субстратам. Короткие повторы последовательности также обеспечивают быстрое эволюционное изменение поверхностных белков у патогенных бактерий; это может позволить им не отставать от иммунологических изменений в организме хозяина. Изменения длины коротких повторов последовательности у гриба (Neurospora crassa) контролируют продолжительность его циркадных часов циклов.
Изменения длины микросателлитов внутри промоторов и другие цис-регуляторные области могут быстро изменять экспрессию генов между поколениями. Геном человека содержит множество (>16000) повторов коротких последовательностей в регуляторных областях, которые обеспечивают «регулировочные ручки» для экспрессии многих генов.
Изменения длины бактериальных SSR могут влиять на формирование фимбрий у Haemophilus influenzae, изменяя расстояние между промоторами. Динуклеотидные микросателлиты связаны с многочисленными вариациями в цис-регуляторных контролирующих областях в геноме человека. Микросателлиты в контрольных регионах гена рецептора вазопрессина 1a у полевок влияют на их социальное поведение и уровень моногамии.
В саркоме Юинга (тип болезненного рака костей у молодых людей) a Точечная мутация создала расширенный микросателлит GGAA, который связывает фактор транскрипции, который, в свою очередь, активирует ген EGR2, который вызывает рак. Кроме того, другие микросателлиты GGAA могут влиять на экспрессию генов, которые влияют на клинический исход пациентов с саркомой Юинга.
Микросателлиты в интронах также влияют на фенотип, с помощью средств, которые в настоящее время не понятны. Например, экспансия триплета GAA в первом интроне гена X25, по-видимому, мешает транскрипции и вызывает атаксию Фридрейха. Тандемные повторы в первом интроне гена аспарагинсинтетазы связаны с острым лимфобластным лейкозом. Полиморфизм повторов в четвертом интроне гена NOS3 связан с гипертонией в тунисской популяции. Уменьшение длины повторов в гене EGFR связано с остеосаркомами.
Известно, что архаичная форма сплайсинга, сохранившаяся у рыбок данио, использует микросателлитные последовательности в интронной мРНК для удаления интронов в отсутствие интронов. U2AF2 и другое сварочное оборудование. Предполагается, что эти последовательности образуют высокостабильные конфигурации клеверного листа, которые сближают сайты сплайсинга 3 'и 5' интронов, эффективно заменяя сплайсосому . Считается, что этот метод сплайсинга РНК отличается от эволюции человека при формировании четвероногих и представляет собой артефакт мира РНК.
Почти 50 % генома человека содержится в различных типах мобильных элементов (также называемых транспозонами или «прыгающими генами»), и многие из них содержат повторяющуюся ДНК. Вероятно, что короткие повторы последовательности в этих местах также участвуют в регуляции экспрессии генов.
Микросателлиты используются для оценки делеций хромосомной ДНК при диагностике рака. Микросателлиты широко используются для профилирования ДНК, также известного как «генетический отпечаток пальца», криминальных пятен (в судебной медицине) и тканей (у пациентов с трансплантатами). Они также широко используются в анализе родства (чаще всего при проверке отцовства). Кроме того, микросателлиты используются для картирования мест в геноме, в частности, в анализе генетической связи для определения местонахождения гена или мутации, ответственных за данный признак или заболевание. Как частный случай картирования, они могут быть использованы для изучения дупликации гена или делеции. Исследователи используют микросателлиты в популяционной генетике и в проектах по сохранению видов. Генетики растений предложили использовать микросателлиты для селекции с помощью маркеров желаемых признаков в селекции растений.
В опухолевых клетках, контроль репликации которых нарушен, микросателлиты могут приобретаться или теряться с особенно высокой частотой во время каждого раунда митоза. Следовательно, линия опухолевых клеток может демонстрировать генетический отпечаток, отличный от такового в ткани хозяина, и, особенно при колоректальном раке, может иметь потерю гетерозиготности. Таким образом, микросателлиты обычно используются в диагностике рака для оценки прогрессирования опухоли.
Частичный профиль STR человека, полученный с помощью Applied Biosystems Identifiler kit Микросателлитный анализ стал популярным в области криминалистики в 1990-х годах. Он используется для генетического дактилоскопирования людей, когда он позволяет провести судебно-медицинскую идентификацию (обычно сопоставление пятна преступления с жертвой или преступником). Он также используется для наблюдения за пациентами с трансплантацией костного мозга.
Микросателлиты, используемые сегодня для судебно-медицинской экспертизы, представляют собой тетра- или пента-нуклеотидные повторы, поскольку они дают высокую степень ошибок. -свободные данные, но достаточно короткие, чтобы выдержать деградацию в неидеальных условиях. Даже более короткие повторяющиеся последовательности будут иметь тенденцию страдать от артефактов, таких как заикание ПЦР и предпочтительная амплификация, в то время как более длинные повторяющиеся последовательности будут более сильно страдать от деградации окружающей среды и будут хуже амплифицироваться при ПЦР. Другое судебно-медицинское соображение заключается в том, что необходимо уважать медицинскую конфиденциальность человека, чтобы для судебно-медицинских экспертиз были выбраны некодирующие, не влияющие на регуляцию генов и обычно не являющиеся тринуклеотидными STR, которые могут быть задействованы в болезни распространения триплетов, такие как болезнь Хантингтона. Криминалистические STR-профили хранятся в банках данных ДНК, таких как Национальная база данных ДНК Великобритании (NDNAD), американская CODIS или Австралийская NCIDD.
Аутосомные микросателлиты широко используются для профилирования ДНК в анализе родства (чаще всего при тестировании на отцовство). Унаследованные от отца Y-STR (микросателлиты на Y-хромосоме ) часто используются в генеалогическом ДНК-тестировании.
В течение 1990-х и Первые несколько лет этого тысячелетия микросателлиты были рабочими генетическими маркерами для полногеномного сканирования, чтобы определить местонахождение любого гена, ответственного за данный фенотип или заболевание, с использованием наблюдений сегрегации в разных поколениях выбранной родословной. Хотя рост производительности и рентабельности однонуклеотидного полиморфизма (SNP) платформ привел к эре SNP для сканирования генома, микросателлиты остаются высокоинформативными показателями геномной изменчивости для исследований сцепления и ассоциации. Их постоянное преимущество заключается в их большем аллельном разнообразии, чем двуаллельные SNP, таким образом, микросателлиты могут дифференцировать аллели в пределах интересующего блока неравновесного сцепления, определенного SNP. Таким образом, микросателлиты успешно привели к открытию генов диабета 2 типа (TCF7L2) и рака простаты (область 8q21).
Консенсус дерево объединения соседей из 249 популяций человека и шести популяций шимпанзе. Создано на основе 246 микросателлитных маркеров. Микросателлиты были популяризированы в популяционной генетике в течение 1990-х годов, потому что, когда ПЦР стала повсеместной в лабораториях, исследователи смогли разработать праймеры и амплифицировать наборы микросателлитов в бюджетный. Их использование очень разнообразно. Микроспутник с нейтральной историей эволюции делает его применимым для измерения или определения узких мест, локальной адаптации, аллельного индекса фиксации (FST),размера популяции и поток генов. Поскольку секвенирование следующего поколения становится более доступным, использование микросателлитов уменьшилось, однако они остаются важным инструментом в этой области.
Выбор с помощью маркеров или с помощью маркеров отбор (MAS) - это процесс непрямого отбора, в котором признак, представляющий интерес, выбирается на основе маркера (морфологический, биохимический или ДНК / РНК вариация), связанная с интересующим признаком (например, продуктивность, устойчивость к болезням, стрессоустойчивость и качество), а не с самим признаком. Было предложено использовать микросателлиты в качестве таких маркеров для помощи в селекции растений.
Повторяющуюся ДНК нелегко проанализировать с помощью методов секвенирования ДНК следующего поколения, которые борются с гомополимерные тракты. Поэтому микросателлиты обычно анализируются с помощью стандартной ПЦР-амплификации и определения размера ампликона, иногда за которым следует секвенирование ДНК по Сэнгеру.
В судебной медицине анализ выполняется путем извлечения ядерной ДНК из клеток образца. представляющих интерес, затем амплифицируют определенные полиморфные области экстрагированной ДНК с помощью полимеразной цепной реакции. После того, как эти последовательности были амплифицированы, они разделяются либо с помощью гель-электрофореза, либо капиллярного электрофореза, что позволяет аналитику определить, сколько существует повторов рассматриваемой последовательности микросателлитов. Если ДНК была разделена с помощью гель-электрофореза, ДНК можно визуализировать либо окрашиванием серебром (низкая чувствительность, безопасно, недорого), либо интеркалирующим красителем, таким как бромистый этидий. (довольно чувствительный, умеренный риск для здоровья, недорогой) или, как используют большинство современных лабораторий судебной экспертизы, флуоресцентные красители (высокочувствительные, безопасные, дорогие). В приборах, предназначенных для разделения фрагментов микросателлитов с помощью капиллярного электрофореза, также используются флуоресцентные красители. Профили судебной экспертизы хранятся в основных банках данных. Британская база данных для идентификации микросателлитных локусов первоначально была основана на британской системе SGM + с использованием 10 локусов и маркера пола. Американцы увеличили это число до 13 локусов. Австралийская база данных называется NCIDD, и с 2013 года она использует 18 основных маркеров для профилирования ДНК.
Микросателлиты могут быть амплифицированы для идентификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием уникальных последовательностей фланкирующих областей в качестве праймеров. ДНК многократно денатурируют при высокой температуре для разделения двойной цепи, затем охлаждают, чтобы обеспечить отжиг праймеров и удлинение нуклеотидных последовательностей через микросателлит. Этот процесс приводит к выработке достаточного количества ДНК, чтобы быть видимым на гелях агарозы или полиакриламида ; только небольшие количества ДНК необходимы для амплификации, потому что таким образом термоциклирование создает экспоненциальное увеличение реплицированного сегмента. Благодаря обилию технологий ПЦР праймеры, фланкирующие микросателлитные локусы, просты и быстры в использовании, но создание правильно функционирующих праймеров часто является утомительным и дорогостоящим процессом.
Ряд образцов ДНК из образцов Littorina plena амплифицировали с использованием полимеразной цепной реакции с праймерами, нацеленными на локус вариабельного простого повтора последовательности (SSR, также известный как микросателлитный). Образцы обрабатывали на 5% -ном полиакриламидном геле и визуализировали с помощью окрашивания серебром. При поиске микросателлитных маркеров в определенных областях генома, например в определенном интроне, праймеры можно конструировать вручную. Это включает поиск в последовательности геномной ДНК микросателлитных повторов, который может быть выполнен на глаз или с помощью автоматизированных инструментов, таких как маскировщик повторов. После определения потенциально полезных микросателлитов фланкирующие последовательности можно использовать для конструирования олигонуклеотидных праймеров, которые будут амплифицировать конкретный микросателлитный повтор в реакции ПЦР.
Случайные микросателлитные праймеры могут быть разработаны путем клонирования случайных сегментов ДНК из основных видов. Эти случайные сегменты вставляют в плазмиду или бактериофаг вектор, который, в свою очередь, имплантируют в бактерии Escherichia coli. Затем развиваются колонии, которые подвергаются скринингу с использованием флуоресцентно меченых последовательностей олигонуклеотидов, которые будут гибридизоваться с микросателлитным повтором, если он присутствует на участке ДНК. Если с помощью этой процедуры могут быть получены положительные клоны, ДНК секвенируется и праймеры для ПЦР выбираются из последовательностей, фланкирующих такие области, для определения конкретного локуса. Этот процесс требует значительных проб и ошибок со стороны исследователей, так как последовательности микросателлитных повторов должны быть предсказаны, а праймеры, выделенные случайным образом, могут не проявлять значительного полиморфизма. Микросателлитные локусы широко распространены по всему геному и могут быть выделены из полуразложившейся ДНК более старых образцов, поскольку все, что требуется, - это подходящий субстрат для амплификации с помощью ПЦР.
Более современные методы включают использование олигонуклеотидных последовательностей, состоящих из повторов, комплементарных повторам в микросателлите, для «обогащения» экстрагированной ДНК (Microsatelline enrichment ). Олигонуклеотидный зонд гибридизуется с повтором в микросателлите, и комплекс зонд / микросателлит затем извлекается из раствора. Затем обогащенная ДНК клонируется как обычно, но доля успешных результатов теперь будет намного выше, что резко сократит время, необходимое для разработки областей для использования. Однако определение того, какие зонды использовать, может быть методом проб и ошибок.
ISSR (для межпростой повтор последовательности ) является общим термином. для области генома между микросателлитными локусами. Комплементарные последовательности двух соседних микросателлитов используются в качестве праймеров для ПЦР; вариабельная область между ними увеличивается. Ограниченная продолжительность циклов амплификации во время ПЦР предотвращает чрезмерную репликацию чрезмерно длинных смежных последовательностей ДНК, поэтому результатом будет смесь множества амплифицированных цепей ДНК, которые обычно короткие, но сильно различаются по длине.
Последовательности, амплифицированные с помощью ISSR-PCR, можно использовать для снятия отпечатков пальцев ДНК. Так как ISSR может быть консервативной или неконсервативной областью, этот метод полезен не для различения индивидуумов, а скорее для филогеографических анализов или, возможно, для определения границ видов ; Разнообразие последовательностей ниже, чем в SSR-PCR, но все же выше, чем в реальных последовательностях генов. Кроме того, микросателлитное секвенирование и ISSR-секвенирование взаимно помогают, поскольку одно производит праймеры для другого.
Повторяющуюся ДНК нелегко проанализировать с помощью методов секвенирования ДНК следующего поколения, которые борются с гомополимерными участками. Поэтому микросателлиты обычно анализируют с помощью обычной ПЦР-амплификации и определения размера ампликона. Использование ПЦР означает, что анализ длины микросателлитов подвержен ограничениям ПЦР, как и любой другой локус ДНК, амплифицированный ПЦР. Особую озабоченность вызывает появление «нулевых аллелей »:
