Войти
Метаболическая сеть, показывающая взаимодействия между ферментами и метаболитами в цикле лимонной кислоты Arabidopsis thaliana. Ферменты и метаболиты - красные точки, а взаимодействия между ними - линии. 
Модель метаболической сети Escherichia coli. Моделирование метаболической сети, также известное как реконструкция метаболической сети или анализ метаболических путей, позволяет глубже понять молекулярные механизмы конкретного организма. В частности, эти модели коррелируют геном с молекулярной физиологией. Реконструкция разбивает метаболические пути (такие как гликолиз и цикл лимонной кислоты ) на соответствующие реакции и ферменты и анализирует их с точки зрения всей сети. Проще говоря, реконструкция собирает всю важную метаболическую информацию организма и компилирует ее в математическую модель. Проверка и анализ реконструкций могут позволить идентифицировать ключевые особенности метаболизма, такие как урожайность роста, распределение ресурсов, надежность сети и важность генов. Эти знания затем могут быть применены для создания новой биотехнологии.
В целом процесс возведения реконструкции выглядит следующим образом:
Родственный метод анализа баланса потоков направлен на математическое моделирование метаболизма при реконструкции метаболических сетей в масштабе генома.
Метаболическая реконструкция обеспечивает высоко математическую структурированную платформу, на которой можно понять системную биологию метаболических путей в организме. Интеграция биохимических метаболических путей с быстро доступными аннотированными последовательностями генома позволила разработать так называемые метаболические модели в масштабе генома. Проще говоря, эти модели коррелируют метаболические гены с метаболическими путями. В целом, чем больше информации о физиологии, биохимии и генетике доступно для целевого организма, тем выше предсказательная способность реконструированных моделей. С механической точки зрения, процесс реконструкции метаболических сетей прокариот и эукариот по сути одинаков. При этом реконструкции эукариот обычно более сложны из-за размера геномов, объема знаний и множества клеточных компартментов. Первая модель метаболизма в масштабе генома была создана в 1995 году для Haemophilus influenzae. Первый многоклеточный организм C. elegans был реконструирован в 1998 году. С тех пор было сформировано множество реконструкций. Список реконструкций, которые были преобразованы в модель и экспериментально подтверждены, см. На http://sbrg.ucsd.edu/InSilicoOrganisms/OtherOrganisms.
| Организм | Гены в геноме | Гены в модели | Реакции | Метаболиты | Дата реконструкции | Ссылка |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Haemophilus influenzae | 1,775 | 296 | 488 | 343 | Июнь 1999 г. | |
| кишечная палочка | 4 405 | 660 | 627 | 438 | Май 2000 г. | |
| Saccharomyces cerevisiae | 6 183 | 708 | 1,175 | 584 | Февраль 2003 г. | |
| Mus musculus | 28 287 | 473 | 1220 | 872 | Январь 2005 г. | |
| Homo sapiens | 21 090 | 3 623 | 3 673 | - | Январь 2007 г. | |
| Микобактерии туберкулеза | 4 402 | 661 | 939 | 828 | Июнь 2007 г. | |
| Bacillus subtilis | 4,114 | 844 | 1,020 | 988 | Сентябрь 2007 г. | |
| Synechocystis sp. PCC6803 | 3 221 | 633 | 831 | 704 | Октябрь 2008 г. | |
| Сальмонелла тифимуриум | 4 489 | 1,083 | 1,087 | 774 | Апрель 2009 г. | |
| Arabidopsis thaliana | 27 379 | 1,419 | 1,567 | 1,748 | Февраль 2010 г. |
Поскольку сроки разработки реконструкций настолько недавние, большинство реконструкций было построено вручную. Однако в настоящее время существует довольно много ресурсов, которые позволяют полуавтоматическую сборку этих реконструкций, которые используются из-за времени и усилий, необходимых для реконструкции. Первоначальная быстрая реконструкция может быть разработана автоматически с использованием таких ресурсов, как PathoLogic или ERGO, в сочетании с энциклопедиями, такими как MetaCyc, а затем обновлена вручную с использованием таких ресурсов, как PathwayTools. Эти полуавтоматические методы позволяют быстро создать черновик, позволяя при этом производить точную настройку, необходимую после обнаружения новых экспериментальных данных. Только так область метаболических реконструкций будет идти в ногу с постоянно растущим числом аннотированных геномов.
| База данных | Сфера | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| Ферменты | Гены | Реакции | Пути | Метаболиты | |
| КЕГГ | Икс | Икс | Икс | Икс | Икс |
| BioCyc | Икс | Икс | Икс | Икс | Икс |
| MetaCyc | Икс | Икс | Икс | Икс | |
| ФЕРМЕНТ | Икс | Икс | Икс | ||
| BRENDA | Икс | Икс | Икс | ||
| BiGG | Икс | Икс | Икс | ||
Это визуальное представление процесса реконструкции метаболической сети. Реконструкция строится путем компиляции данных из указанных выше ресурсов. Инструменты базы данных, такие как KEGG и BioCyc, можно использовать в сочетании друг с другом для поиска всех метаболических генов в интересующем организме. Эти гены будут сравниваться с близкородственными организмами, которые уже разработали реконструкции, чтобы найти гомологичные гены и реакции. Эти гомологичные гены и реакции заимствованы из известных реконструкций, чтобы сформировать предварительную реконструкцию интересующего организма. Такие инструменты, как ERGO, Pathway Tools и Model SEED, могут объединять данные в пути, чтобы сформировать сеть метаболических и неметаболических путей. Затем эти сети проверяются и уточняются, прежде чем они будут преобразованы в математическое моделирование.
Прогнозирующий аспект метаболической реконструкции зависит от способности предсказать биохимическую реакцию, катализируемую белком, используя аминокислотную последовательность этого белка в качестве входных данных, и сделать вывод о структуре метаболической сети на основе предсказанного набора реакций. Создана сеть ферментов и метаболитов, чтобы связать последовательности и функции. Когда в геноме обнаруживается неохарактеризованный белок, его аминокислотная последовательность сначала сравнивается с таковыми ранее охарактеризованных белков для поиска гомологии. Когда гомологичный белок обнаруживается, считается, что у белков есть общий предок, и их функции считаются схожими. Однако качество модели реконструкции зависит от ее способности точно определять фенотип непосредственно из последовательности, поэтому такой приблизительной оценки функции белка будет недостаточно. Ряд алгоритмов и ресурсов биоинформатики был разработан для уточнения назначений функций белков на основе гомологии последовательностей:
После того, как белки установлены, дополнительную информацию о структуре фермента, катализируемых реакциях, субстратах и продуктах, механизмах и многом другом можно получить из таких баз данных, как KEGG, MetaCyc и NC-IUBMB. Для точных реконструкций метаболизма требуется дополнительная информация об обратимости и предпочтительном физиологическом направлении реакции, катализируемой ферментами, которая может быть получена из таких баз данных, как BRENDA или MetaCyc.
Первоначальная метаболическая реконструкция генома обычно далека от совершенства из-за высокой изменчивости и разнообразия микроорганизмов. Часто в базах данных метаболических путей, таких как KEGG и MetaCyc, есть «дыры», означающие, что происходит преобразование субстрата в продукт (т.е. ферментативная активность), для которого в геноме нет известного белка, кодирующего фермент, который облегчает катализ. Что также может случиться в полуавтоматических реконструкциях, так это то, что некоторые пути неверно предсказаны и на самом деле не происходят предсказанным образом. По этой причине проводится систематическая проверка, чтобы убедиться в отсутствии несоответствий и в том, что все перечисленные записи верны и точны. Кроме того, можно изучить предыдущую литературу, чтобы подтвердить любую информацию, полученную из одной из многих баз данных о метаболических реакциях и геномах. Это обеспечивает дополнительный уровень уверенности в том, что фермент и реакция, которую он катализирует, действительно происходят в организме.
Промискуитет ферментов и спонтанные химические реакции могут повредить метаболиты. Это повреждение метаболитов и их восстановление или упреждение приводят к затратам энергии, которые необходимо учитывать в моделях. Вероятно, что многие гены с неизвестной функцией кодируют белки, которые восстанавливают или предотвращают повреждение метаболитов, но большинство метаболических реконструкций в масштабе генома включают только часть всех генов.
Любая новая реакция, отсутствующая в базах данных, должна быть добавлена к реконструкции. Это итеративный процесс, который циклически проходит между экспериментальной фазой и фазой кодирования. По мере обнаружения новой информации о целевом организме модель будет скорректирована для прогнозирования метаболического и фенотипического выхода клетки. Наличие или отсутствие определенных реакций метаболизма будет влиять на количество реагентов / продуктов, которые присутствуют для других реакций в рамках конкретного пути. Это связано с тем, что продукты одной реакции становятся реагентами для другой реакции, то есть продукты одной реакции могут объединяться с другими белками или соединениями с образованием новых белков / соединений в присутствии различных ферментов или катализаторов.
Francke et al. представляют собой отличный пример того, почему этап проверки проекта необходимо выполнять со значительными подробностями. Во время реконструкции метаболической сети Lactobacillus plantarum модель показала, что сукцинил-КоА был одним из реагентов для реакции, которая была частью биосинтеза метионина. Однако понимание физиологии организма показало бы, что из-за неполного пути трикарбоновых кислот Lactobacillus plantarum на самом деле не производит сукцинил-КоА, и правильным реагентом для этой части реакции был ацетил-КоА.
Следовательно, систематическая проверка первоначальной реконструкции выявит несколько несоответствий, которые могут отрицательно повлиять на окончательную интерпретацию реконструкции, которая заключается в точном понимании молекулярных механизмов организма. Кроме того, этап моделирования также гарантирует, что все реакции, присутствующие в реконструкции, должным образом сбалансированы. Подводя итог, можно сказать, что полностью точная реконструкция может привести к лучшему пониманию функционирования интересующего организма.
Метаболическая сеть может быть разбита на стехиометрическую матрицу, где строки представляют собой соединения реакций, а столбцы матрицы соответствуют самим реакциям. Стехиометрия - это количественное соотношение между субстратами химической реакции. Чтобы сделать вывод о том, что предлагает метаболическая сеть, недавние исследования были сосредоточены на нескольких подходах, таких как экстремальные пути, анализ элементарных режимов, анализ баланса потоков и ряд других методов моделирования на основе ограничений.
Прайс, Рид и Папин из лаборатории Палссона используют метод разложения по сингулярным значениям (SVD) экстремальных путей, чтобы понять регуляцию метаболизма эритроцитов человека. Экстремальные пути - это выпуклые базисные векторы, которые состоят из функций устойчивого состояния метаболической сети. Для любой конкретной метаболической сети всегда доступен уникальный набор экстремальных путей. Кроме того, Прайс, Рид и Папин определяют подход, основанный на ограничениях, когда с помощью ограничений, таких как баланс массы и максимальная скорость реакции, можно разработать «пространство решений», в которое входят все возможные варианты. Затем, используя подход кинетической модели, можно определить единственное решение, которое попадает в пространство решений экстремального пути. Поэтому в своем исследовании Прайс, Рид и Папин используют как ограничивающие, так и кинетические подходы для понимания метаболизма эритроцитов человека. В заключение, используя экстремальные пути, можно более подробно изучить регуляторные механизмы метаболической сети.
Анализ элементарного режима близко соответствует подходу, используемому для экстремальных путей. Подобно экстремальным путям, всегда существует уникальный набор элементарных режимов, доступных для конкретной метаболической сети. Это самые маленькие подсети, которые позволяют сети метаболической реконструкции функционировать в устойчивом состоянии. Согласно Стеллингу (2002), элементарные режимы могут использоваться для понимания клеточных целей для всей метаболической сети. Кроме того, анализ элементарного режима учитывает стехиометрию и термодинамику при оценке того, возможен ли и вероятен ли конкретный метаболический путь или сеть для набора белков / ферментов.
В 2009 году Лархлими и Бокмайр представили новый подход под названием «минимальное метаболическое поведение» для анализа метаболических сетей. Как элементарные моды или экстремальные пути, они однозначно определяются сетью и дают полное описание конуса потока. Однако новое описание намного компактнее. В отличие от элементарных режимов и экстремальных путей, которые используют внутреннее описание, основанное на генерировании векторов конуса потока, MMB используют внешнее описание конуса потока. Этот подход основан на наборах ограничений неотрицательности. Они могут быть идентифицированы как необратимые реакции и, таким образом, имеют прямую биохимическую интерпретацию. Метаболическую сеть можно охарактеризовать с помощью MMB и обратимого метаболического пространства.
Другой метод моделирования метаболической сети - выполнить анализ баланса потоков. В этом методе используется линейное программирование, но, в отличие от анализа в элементарных режимах и экстремальных траекторий, только одно решение приводит к окончательному результату. Линейное программирование обычно используется для получения максимального потенциала целевой функции, на которую вы смотрите, и, следовательно, при использовании анализа баланса потоков найдено единственное решение проблемы оптимизации. В подходе анализа баланса потоков обменные потоки назначаются тем метаболитам, которые входят или выходят только из конкретной сети. Те метаболиты, которые потребляются в сети, не имеют значения обменного потока. Кроме того, обменные потоки вместе с ферментами могут иметь ограничения в диапазоне от отрицательного до положительного значения (например: от -10 до 10).
Кроме того, этот конкретный подход может точно определить, соответствует ли стехиометрия реакции прогнозам, обеспечивая потоки для сбалансированных реакций. Кроме того, анализ баланса потоков может выявить наиболее эффективный и действенный путь через сеть для достижения конкретной целевой функции. Кроме того, исследования нокаута гена могут быть выполнены с использованием анализа баланса потока. Фермент, который коррелирует с геном, который необходимо удалить, получает ограничивающее значение 0. Затем реакция, которую катализирует конкретный фермент, полностью удаляется из анализа.
Чтобы выполнить динамическое моделирование с такой сетью, необходимо построить систему обыкновенных дифференциальных уравнений, которая описывает скорости изменения концентрации или количества каждого метаболита. С этой целью для каждой реакции требуется закон скорости, то есть кинетическое уравнение, которое определяет скорость реакции на основе концентраций всех реагентов. Пакеты программного обеспечения, которые включают числовые интеграторы, такие как COPASI или SBMLsimulator, затем могут моделировать динамику системы с учетом начальных условий. Часто эти скоростные законы содержат кинетические параметры с неопределенными значениями. Во многих случаях желательно оценить значения этих параметров по отношению к данным временного ряда концентраций метаболитов. Затем предполагается, что система воспроизводит заданные данные. Для этого вычисляется расстояние между заданным набором данных и результатом моделирования, т. Е. Численно или, в некоторых случаях, аналитически полученным решением системы дифференциальных уравнений. Затем оцениваются значения параметров, чтобы минимизировать это расстояние. На следующем этапе может потребоваться оценка математической структуры системы дифференциальных уравнений, поскольку законы реальной скорости не известны для реакций в исследуемой системе. С этой целью программа SBMLsqueezer позволяет автоматически создавать соответствующие законы скорости для всех реакций в сети.
Синтетическая доступность - это простой подход к сетевому моделированию, цель которого - предсказать, какие метаболические нокауты генов являются летальными. Подход синтетической доступности использует топологию метаболической сети для вычисления суммы минимального количества шагов, необходимых для пересечения графа метаболической сети от входов, тех метаболитов, которые доступны организму из окружающей среды, до выходов, метаболитов, необходимых для организм, чтобы выжить. Чтобы смоделировать нокаут гена, реакции, задействованные геном, удаляются из сети, а метрика синтетической доступности пересчитывается. Прогнозируется, что увеличение общего количества шагов приведет к летальному исходу. Вундерлих и Мирный продемонстрировали этот простой, свободный от параметров подход, предсказывающий летальность от нокаута для E. coli и S. cerevisiae, а также анализ элементарных режимов и анализ баланса потоков в различных средах.
Реконструкции и соответствующие им модели позволяют формулировать гипотезы о наличии определенных ферментативных активностей и продукции метаболитов, которые могут быть экспериментально проверены, дополняя преимущественно основанный на открытиях подход традиционной микробной биохимии с исследованиями, основанными на гипотезах. Результаты этих экспериментов могут раскрыть новые пути и метаболические активности, а также расшифровать расхождения в предыдущих экспериментальных данных. Информация о химических реакциях метаболизма и генетическом фоне различных метаболических свойств (от последовательности к структуре к функции) может использоваться генными инженерами для модификации организмов с целью получения ценных результатов, независимо от того, являются ли эти продукты релевантными с медицинской точки зрения, как фармацевтические препараты; ценные химические промежуточные продукты, такие как терпеноиды и изопреноиды; или биотехнологические продукты, такие как биотопливо.
Реконструкции и модели метаболической сети используются для понимания того, как организм или паразит функционируют внутри клетки-хозяина. Например, если паразит нарушает работу иммунной системы, лизируя макрофаги, то цель метаболической реконструкции / моделирования будет заключаться в определении метаболитов, которые необходимы для размножения организма внутри макрофагов. Если цикл размножения заторможен, паразит не сможет продолжать уклоняться от иммунной системы хозяина. Модель реконструкции служит первым шагом к расшифровке сложных механизмов, окружающих болезнь. Эти модели могут также рассматривать минимальные гены, необходимые клетке для поддержания вирулентности. Следующим шагом будет использование прогнозов и постулатов, созданных на основе модели реконструкции, и их применение для открытия новых биологических функций, таких как разработка лекарств и методы доставки лекарств.
