Секвенирование Максама – Гилберта

редактировать

Секвенирование Максама – Гилберта - это метод секвенирования ДНК, разработанный Алланом Максамом и Уолтером Гилбертом в 1976–1977 годах. Этот метод основан на специфичной для азотистых оснований частичной химической модификации ДНК и последующем расщеплении основной цепи ДНК в сайтах, прилегающих к модифицированным нуклеотидам.

Пример реакции Максама – Гилберта секвенирования. Расщепление одного и того же помеченного сегмента ДНК в разных точках дает меченые фрагменты разного размера. Затем фрагменты можно разделить с помощью гель-электрофореза.

Секвенирование Максама – Гилберта было первым широко принятым методом секвенирования ДНК и, наряду с методом дидезокси Сэнгера, представляет собой первое поколение методов секвенирования ДНК. Секвенирование Максама – Гилберта больше не широко используется, его вытеснили методы секвенирования следующего поколения.

СОДЕРЖАНИЕ

  • 1 История
  • 2 Процедура
  • 3 Связанные методы
  • 4 ссылки

История

Хотя Максам и Гилберт опубликовали свой метод химического секвенирования через два года после того, как Фредерик Сэнгер и Алан Коулсон опубликовали свою работу по положительно-отрицательному секвенированию, секвенирование Максама-Гилберта быстро стало более популярным, поскольку очищенную ДНК можно было использовать напрямую, в то время как первоначальный метод Сэнгера требовал этого. каждое начало чтения должно быть клонировано для получения одноцепочечной ДНК. Однако с улучшением метода обрыва цепи (см. Ниже) секвенирование Максама-Гилберта вышло из моды из-за своей технической сложности, запрещающей его использование в стандартных наборах молекулярной биологии, широкого использования опасных химических веществ и трудностей с масштабированием. вверх.

Статья Аллана Максама и Уолтера Гилберта 1977 года «Новый метод секвенирования ДНК» была удостоена награды Citation for Chemical Breakthrough от Отдела истории химии Американского химического общества за 2017 год. Она была представлена ​​Департаменту молекулярной и клеточной биологии., Гарвардский университет.

Процедура

Секвенирование Максама-Гилберта требует радиоактивного мечения на одном 5'-конце фрагмента ДНК, который необходимо секвенировать (обычно с помощью киназной реакции с использованием гамма- 32 P АТФ ) и очистки ДНК. Химическая обработка приводит к разрыву небольшого количества одного или двух из четырех нуклеотидных оснований в каждой из четырех реакций (G, A + G, C, C + T). Например, пурины (A + G) депуринируются с использованием муравьиной кислоты, гуанины (и в некоторой степени аденины ) метилируются диметилсульфатом, а пиримидины (C + T) гидролизуются с использованием гидразина. Добавление соли ( хлорида натрия ) к реакции с гидразином ингибирует реакцию тимина на реакцию только с углеродом. Затем модифицированные ДНК могут быть расщеплены горячим пиперидином ; (CH 2) 5 NH в положении модифицированного основания. Концентрация модифицирующих химикатов контролируется для введения в среднем одной модификации на молекулу ДНК. Таким образом образуется серия меченых фрагментов от конца с радиоактивной меткой до первого «разрезанного» сайта в каждой молекуле.

Фрагменты в четырех реакциях подвергают электрофорезу бок о бок в денатурирующих акриламидных гелях для разделения по размеру. Чтобы визуализировать фрагменты, гель экспонируют на рентгеновской пленке для авторадиографии, получая серию темных полос, каждая из которых показывает расположение идентичных радиоактивно меченных молекул ДНК. По наличию и отсутствию определенных фрагментов можно сделать вывод о последовательности.

Связанные методы

Этот метод привел к анализу интерференции метилирования, используемому для картирования ДНК-связывающих сайтов для ДНК-связывающих белков.

В 1994 году был разработан автоматический протокол секвенирования Максама – Гилберта.

использованная литература

Последняя правка сделана 2024-01-02 02:43:22
Содержание доступно по лицензии CC BY-SA 3.0 (если не указано иное).
Обратная связь: support@alphapedia.ru
Соглашение
О проекте