Войти
Общая схема, показывающая отношения липидома к геному, транскриптому, протеом и метаболом. Липиды также регулируют функцию белков и транскрипцию генов как часть динамического «интерактома» внутри клетки. Lipidomics - это крупномасштабное исследование путей и сетей клеточных липидов в биологических системах. Слово «липидом » используется для описания полного липидного профиля в клетке, ткани, организме или экосистеме и является подмножеством «метаболом », которое также включает три других основных классы биологических молекул: белки / аминокислоты, сахара и нуклеиновые кислоты. Липидомика - это относительно недавняя область исследований, которая была обусловлена быстрым развитием таких технологий, как масс-спектрометрия (МС), спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР), флуоресцентная спектроскопия, интерферометрия с двойной поляризацией и вычислительные методы в сочетании с признанием роли липидов во многих метаболических заболеваниях, таких как ожирение, атеросклероз, инсульт, гипертония и диабет. Эта быстро расширяющаяся область дополняет огромный прогресс, достигнутый в геномике и протеомике, которые составляют семейство системной биологии.
Исследования липидомики включают идентификацию и количественную оценку тысяч видов клеточных липидных молекул и их взаимодействия с другими липидами., белки и другие метаболиты. Исследователи в области липидомики изучают структуры, функции, взаимодействия и динамику клеточных липидов, а также изменения, которые происходят во время нарушения работы системы.
Хан и Гросс впервые определили область липидомики, объединив специфические химические свойства, присущие видам молекул липидов, с комплексным масс-спектрометрическим подходом. Хотя липидомика находится под зонтиком более общей области «метаболомики », липидомика сама по себе является отдельной дисциплиной из-за уникальности и функциональной специфичности липидов по сравнению с другими метаболитами.
В липидомных исследованиях огромное количество информации, количественно описывающей пространственные и временные изменения в содержании и составе различных липидных молекулярных видов, накапливается после возмущения клетки через изменения ее физиологического или патологического состояния. Информация, полученная в результате этих исследований, помогает понять механизмы изменения клеточной функции. Следовательно, липидомные исследования играют важную роль в определении биохимических механизмов связанных с липидами процессов заболевания посредством выявления изменений клеточного липидного метаболизма, транспорта и гомеостаза. Растущее внимание к липидным исследованиям также видно из инициатив, реализуемых в рамках стратегии LIPID Metabolites And Pathways (LIPID MAPS Консорциум). и Европейская липидомическая инициатива (ELIfe).
Примеры некоторых липидов из различных категорий. Липиды - это разнообразная и повсеместная группа соединений, которые выполняют многие ключевые биологические функции, например, действуют как структурные компоненты клеточных мембран, служащие источниками хранения энергии и участвующие в сигнальных путях. Липиды можно в широком смысле определить как гидрофобные или амфипатические небольшие молекулы, которые полностью или частично происходят из двух различных типов биохимических субъединиц или «строительных блоков»: и изопрен группы. Огромное структурное разнообразие липидов возникает в результате биосинтеза различных комбинаций этих строительных блоков. Например, глицерофосфолипиды состоят из основной цепи глицерина, связанной с одной из примерно 10 возможных головных групп, а также с 2 жирными ацил / алкил цепями, которые, в свою очередь, могут имеют 30 или более различных молекулярных структур. На практике не все возможные перестановки обнаруживаются экспериментально из-за предпочтений цепей в зависимости от типа клеток, а также пределов обнаружения - тем не менее, в клетках млекопитающих было обнаружено несколько сотен различных молекулярных видов глицерофосфолипидов.
Растительные тилакоидные мембраны хлоропластов, однако, имеют уникальный липидный состав, поскольку в них отсутствует фосфолипиды. Кроме того, их самый крупный компонент, моногалактозилдиглицерид или MGDG, не образует водных бислоев. Тем не менее, динамические исследования показывают нормальную организацию липидного бислоя в тилакоидных мембранах.
Большинство методов экстракции липидов и выделения из биологических образцов используют их высокую растворимость. углеводородных цепей в органических растворителях. Учитывая разнообразие классов липидов, невозможно объединить все классы с помощью единого метода экстракции. В традиционной методике Блая / Дайера используются протоколы на основе хлороформа / метанола, которые включают разделение фаз на органический слой. Эти протоколы относительно хорошо работают для широкого ряда физиологически релевантных липидов, но они должны быть адаптированы для сложных липидных химикатов и низкосодержащих и лабильных метаболитов липидов. При использовании органической почвы цитрат буфер в экстракционной смеси давал более высокие количества липидного фосфатного, чем ацетатный буфер, Трис, H2O или фосфатный буфер.
Простейшим методом разделения липидов является использование тонкослойной хроматографии (ТСХ). Хотя он не такой чувствительный, как другие методы определения липидов, он предлагает быстрый и всесторонний инструмент для скрининга, предшествующий более чувствительным и сложным методам. Хроматография твердофазной экстракции (ТФЭ) полезна для быстрого препаративного разделения сырых липидных смесей на разные классы липидов. Это предполагает использование предварительно набитых колонок, содержащих диоксид кремния или другие неподвижные фазы для разделения глицерофосфолипидов, жирных кислот, эфиров холестерила, глицеролипиды и стеролы из сырых липидных смесей. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ или ЖХ) широко используется в липидомном анализе для разделения липидов перед масс-анализом. Разделение может быть достигнуто с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой (NP) или ВЭЖХ с обращенной фазой (RP). Например, NP-HPLC эффективно разделяет глицерофосфолипиды на основе полярности головной группы, тогда как RP-HPLC эффективно разделяет жирные кислоты, такие как эйкозаноиды, на основе длины цепи, степени ненасыщенности и замещения. Для глобальных нецелевых липидомных исследований обычно используют колонки как RP, так и NP или жидкостной хроматографии с гидрофильным взаимодействием (HILC) для увеличения липидомного покрытия. Таким образом, применение нанопроточной жидкостной хроматографии (НЖК) оказалось наиболее эффективным для повышения как общей чувствительности измерения, так и покрытия липидомом для глобального липидомного подхода. Хроматографическое (ВЭЖХ / УВЭЖХ) разделение липидов можно проводить в автономном или интерактивном режиме, когда элюат объединяется с источником ионизации масс-спектрометра.
Прогресс современной липидомики был значительно ускорен развитием спектрометрических методов в целом и методов мягкой ионизации для масс-спектрометрии, таких как ионизация электрораспылением (ESI), В частности, десорбционная ионизация электрораспылением (DESI) и матричная лазерная десорбция / ионизация (MALDI). «Мягкая» ионизация не вызывает обширной фрагментации, поэтому всестороннее обнаружение всего диапазона липидов в сложной смеси можно соотнести с экспериментальными условиями или болезненным состоянием. Кроме того, метод химической ионизации при атмосферном давлении (APCI) становится все более популярным для анализа неполярных липидов.
Схема, показывающая обнаружение жирной кислоты с помощью ЖХ-МС / МС с использованием линейного прибора с ионной ловушкой и электроспрея. (ESI) ионный источник. ESI-MS был первоначально разработан Фенном и его коллегами для анализа биомолекул. Это зависит от образования газообразных ионов из полярных, термически лабильных и в основном нелетучих молекул и, таким образом, полностью подходит для множества липидов. Это метод мягкой ионизации, который редко нарушает химическую природу анализируемого вещества перед масс-анализом. Различные методы ESI-MS были разработаны для анализа различных классов, подклассов и отдельных видов липидов из биологических экстрактов. Недавно были опубликованы подробные обзоры методов и их применения. Основными преимуществами ESI-MS являются высокая точность, чувствительность, воспроизводимость и применимость метода к комплексным решениям без предварительной дериватизации. Хан и его коллеги разработали метод, известный как «липидомика дробовика», который включает прямую инфузию сырого липидного экстракта в источник ESI, оптимизированный для разделения липидов внутри источника на основе их внутренних электрических свойств.
Масс-спектрометрия DESI - это метод ионизации окружающей среды, разработанный профессором Золтаном Такатсом и др. В группе профессора Грэма Кука из Университета Пердью. Он сочетает в себе методы ESI и десорбционной ионизации, направляя электрически заряженный туман на поверхность образца, которая находится на расстоянии нескольких миллиметров. Этот метод был успешно применен в липидомике как инструмент визуализации для картирования распределения липидов в образцах тканей. Одно из преимуществ DESI MS заключается в том, что для подготовки ткани не требуется матрица, что позволяет проводить несколько последовательных измерений на одном и том же образце ткани.
MALDI масс-спектрометрия - это основанный на лазере метод мягкой ионизации, часто используемый для анализа больших белков, но успешно применяемый для липидов. Липид смешивают с матрицей, такой как 2,5-дигидроксибензойная кислота, и наносят на держатель образца в виде небольшого пятна. В пятно попадает лазер, и матрица поглощает энергию, которая затем передается аналиту, что приводит к ионизации молекулы. MALDI-Time-of-Flight (MALDI-TOF) MS стал очень многообещающим подходом для липидомических исследований, особенно для визуализации липидов на тканевых слайдах.
Источник для APCI аналогичен ESI, за исключением того, что ионы образуются при взаимодействии нагретого аналита-растворителя с иглой коронного разряда, установленной на высокий электрический потенциал. Первичные ионы образуются непосредственно вокруг иглы, и они взаимодействуют с растворителем с образованием вторичных ионов, которые в конечном итоге ионизируют образец. APCI особенно полезен для анализа неполярных липидов, таких как триацилглицерины, стерины и сложные эфиры жирных кислот.
Высокая чувствительность DESI в диапазоне липидов делает его мощным методом для обнаружение и картирование содержания липидов в образцах тканей. Недавние разработки в методах MALDI сделали возможным прямое обнаружение липидов на месте. Изобилие связанных с липидами ионов производится в результате прямого анализа тонких срезов ткани, когда последовательные спектры снимаются на поверхности ткани, покрытой матрицей MALDI. Активация столкновением молекулярных ионов может использоваться для определения семейства липидов и часто структурно определять молекулярные разновидности. Эти методы позволяют обнаруживать фосфолипиды, сфинголипиды и глицеролипиды в таких тканях, как сердце, почки и мозг. Кроме того, распределение многих различных видов молекул липидов часто определяет анатомические области в этих тканях.
Количественные липидные профили (липидомы) дрожжей Saccharomyces cerevisiae выращивание при различных температурах Липидный профиль - это платформа для целевой метаболомики, которая обеспечивает всесторонний анализ липидных видов в клетке или ткани. Профилирование, основанное на тандемной масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI-MS / MS), позволяет получать количественные данные и может быть адаптировано для высокопроизводительных анализов. Мощный подход трансгенов, а именно делеция и / или сверхэкспрессия продукта гена в сочетании с липидомикой, может дать ценную информацию о роли биохимических путей. Методы липидного профилирования также применялись к растениям и микроорганизмам, таким как дрожжи. Комбинация количественных липидомных данных в сочетании с соответствующими транскрипционными данными (с использованием методов генного массива) и протеомными данными (с использованием тандемного МС) позволяет использовать подход системной биологии к более глубокое понимание интересующих метаболических или сигнальных путей.
Основная проблема липидомики, в частности подходов на основе МС, заключается в вычислительных и биоинформатических требованиях обработки большого количества данных, которые возникают на различных этапах цепочки сбор и обработка информации. Сбор хроматографических и масс-спектрометрических данных требует значительных усилий по выравниванию спектров и статистической оценке флуктуаций интенсивности сигналов. Такие вариации имеют множество причин, включая биологические вариации, обработку образцов и аналитическую точность. Как следствие, обычно требуется несколько повторов для надежного определения уровней липидов в сложных смесях. В течение последних нескольких лет различные компании и исследовательские группы разработали ряд программных пакетов для анализа данных, полученных в результате профилирования метаболитов, в том числе липидов, методом МС. Обработка данных для дифференциального профилирования обычно проходит в несколько этапов, включая манипулирование входным файлом, спектральную фильтрацию, обнаружение пиков, хроматографическое выравнивание, нормализацию, визуализацию и экспорт данных. Примером программного обеспечения для метаболического профилирования является бесплатное приложение Mzmine на базе Java. Недавно программное обеспечение MS-DIAL 4 было интегрировано с всеобъемлющим атласом липидома с информацией о времени удерживания, сечении столкновений и тандемной масс-спектрометрии для 117 подклассов липидов и 8051 липидов. Некоторые программные пакеты, такие как Markerview, включают многомерный статистический анализ (например, анализ главных компонентов), и он будет полезен для идентификации корреляций в липидных метаболитах, которые связаны с физиологическим фенотипом, в частности для разработки липидных биомаркеров. Другая цель информационной технологии липидомики заключается в построении метаболических карт на основе данных о липидных структурах и липид-связанных белках и генах. Некоторые из этих липидных путей чрезвычайно сложны, например, гликосфинголипидный путь млекопитающих. Создание доступных для поиска и интерактивных баз данных липидов и связанных с липидами генов / белков также является чрезвычайно важным ресурсом в качестве справочного материала для сообщества липидомиков. Интеграция этих баз данных с РС и другими экспериментальными данными, а также с метаболическими сетями дает возможность разработать терапевтические стратегии для предотвращения или обращения вспять этих патологических состояний, связанных с дисфункцией процессов, связанных с липидами.
 | На Викискладе есть материалы, связанные с липидомикой и липидами. |
