Войти
Организация липидного рафта, область (1) представляет собой стандартный липидный бислой, а область (2) - липидный плот. плазматические мембраны клеток содержат комбинации гликосфинголипидов, холестериновых и белковых рецепторов, организованных в гликолипопротеин липидные микродомены, называемые липидными рафтами . Их существование в клеточных мембранах остается несколько спорным. Было высказано предположение, что они представляют собой специализированные мембранные микродомены, которые разделяют клеточные процессы, служа организующими центрами для сборки сигнальных молекул, обеспечивая более тесное взаимодействие белковых рецепторов и их эффекторов для обеспечения кинетически благоприятных взаимодействий, необходимых для передача сигнала. Липидные рафты влияют на текучесть мембран и мембранный белок трафик, тем самым регулируя нейротрансмиссию и передачу рецепторов. Липидные рафты более упорядочены и плотно упакованы, чем окружающий бислой, но свободно плавают внутри мембранного бислоя. Хотя липидные рафты чаще встречаются в клеточной мембране, сообщалось также о других частях клетки, таких как аппарат Гольджи и лизосомы.
Модели заполнения пространства сфингомиелином (а) и холестерином (b) Одним из ключевых различий между липидными рафтами и плазматическими мембранами, из которых они получены, является липидный состав. Исследования показали, что липидные рафты содержат от 3 до 5-кратное количество холестерина, обнаруживаемого в окружающем бислое. Кроме того, липидные рафты обогащены сфинголипидами, такими как сфингомиелин, содержание которого обычно увеличивается на 50% по сравнению с плазматической мембраной. Чтобы компенсировать повышенные уровни сфинголипидов, уровни фосфатидилхолина снижены, что приводит к аналогичным уровням холин липидов между рафтами и окружающей плазматической мембраной. Холестерин взаимодействует преимущественно, хотя и не исключительно, со сфинголипидами из-за их структуры и насыщенности углеводородных цепей. Хотя не все фосфолипиды внутри рафта полностью насыщены, гидрофобные цепи липидов, содержащихся в рафте, более насыщены и плотно упакованы, чем окружающий бислой. Холестерин - это динамический «клей», скрепляющий плот. Из-за жесткой природы стериновой группы холестерин предпочтительно разделяется на липидные рафты, где ацильные цепи липидов имеют тенденцию быть более жесткими и в менее жидком состоянии. Одним из важных свойств мембранных липидов является их амфипатический характер. Амфипатические липиды имеют полярную гидрофильную головную группу и неполярную гидрофобную область. На рисунке справа показана форма сфингомиелина в форме перевернутого конуса и форма холестерина в виде конуса в зависимости от площади пространства, занимаемого гидрофобной и гидрофильной областями. Холестерин может скапливаться между липидами в рафтах, выступая в качестве молекулярного спейсера и заполняя любые пустоты между связанными сфинголипидами.
Ритвельд и Саймонс связали липидные рафты в модельных мембранах с несмешиваемостью упорядоченной (фазы Lo ) и неупорядоченная () жидкие фазы. Причина этой несмешиваемости неясна, но считается, что несмешиваемость минимизирует свободную энергию между двумя фазами. Исследования показали, что существует разница в толщине липидных рафтов и окружающей мембраны, что приводит к гидрофобному несоответствию на границе между двумя фазами. Было показано, что это несоответствие фазовой высоты увеличивает натяжение линии, что может привести к образованию более крупных и круглых платформ плота, чтобы минимизировать энергетические затраты на поддержание плотов как отдельной фазы. Другие спонтанные события, такие как искривление мембраны и слияние малых плотностей с более крупными, также могут минимизировать натяжение линии.
Согласно одному раннему определению липидных рафтов, липидные рафты отличаются от остальной части плазматической мембраны. Фактически, исследователи выдвинули гипотезу, что липидные рафты могут быть извлечены из плазматической мембраны. Экстракция могла бы использовать преимущество устойчивости липидного слоя к неионным детергентам, таким как Triton X-100 или Brij-98, при низких температурах (например, 4 ° C). Когда такой детергент добавляется к клеткам, жидкая мембрана растворяется, в то время как липидные рафты могут оставаться неповрежденными и могут быть извлечены.
Из-за их состава и устойчивости к детергентам липидные рафты также называются нерастворимыми в детергенте гликолипидами обогащенные комплексы (GEM) или DIG или устойчивые к моющим средствам мембраны (DRM). Однако достоверность методологии определения устойчивости мембран к детергентам недавно была поставлена под сомнение из-за неоднозначности извлеченных липидов и белков и наблюдения, что они также могут вызывать образование твердых участков там, где их раньше не было.
Опосредование презентации субстрата. Липидные рафты локализуют пальмитоилированные белки вдали от неупорядоченной области плазматической мембраны. Нарушение опосредованной пальмитатом локализации затем позволяет подвергнуть белок его связывающему партнеру или субстрату в неупорядоченной области, механизм активации называется презентация субстрата. Например, белок часто пальмитоилирован и связывает 4,5-бифосфат (PIP2). PIP2 полиненасыщен и не находится в липидных рафтах. Когда уровни PIP2 увеличиваются в плазматической мембране, белок переходит в кластеры PIP2, где он может быть активирован непосредственно PIP2 или другой молекулой, которая ассоциируется с PIP2.
Возможно, существуют другие функции.
До 1982 года было широко распространено мнение, что фосфолипиды и мембранные белки были случайным образом распределены в клеточных мембранах, согласно Зингеру-Николсону. модель жидкой мозаики, опубликованная в 1972 году. Однако мембранные микродомены были постулированы в 1970-х годах с использованием биофизических подходов Stier Sackmann и Klausner Karnovsky. Эти микродомены были приписаны физическим свойствам и организации липидных смесей Stier Sackmann и Israelachvili et al. В 1974 г. влияние температуры на поведение мембран привело к предложению «кластеров липидов» в мембранах, а к 1975 г. данные показали, что эти кластеры могут быть «квазикристаллическими» областями внутри более свободно диспергированной жидкокристаллической молекулы липида. В 1978 году исследования дифракции рентгеновских лучей привели к дальнейшему развитию идеи «кластеров», определяющей микродомены как «липиды в более упорядоченном состоянии». Карновский и его сотрудники формализовали концепцию липидных доменов в мембранах в 1982 году. Исследования Карновского показали гетерогенность в распаде времени жизни 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриена, что указывает на наличие нескольких фаз в липидном окружении. мембраны. Один тип микродомена состоит из холестерина и сфинголипидов. Они образуются из-за разделения этих липидов в отдельную фазу, что было продемонстрировано Билтоненом и Томпсоном и их коллегами. Было показано, что эти микродомены («рафты») существуют также в клеточных мембранах. Позже Кай Симонс из Европейской лаборатории молекулярной биологии (EMBL) в Германии и Геррит ван Меер из Утрехтского университета, Нидерланды, переориентировали интерес на эти мембранные микродомены., обогащенные липидами и холестерином, гликолипидами и сфинголипидами, присутствующими в клеточных мембранах. Впоследствии они назвали эти микродомены липидными «плотами». Первоначальная концепция рафтов была использована для объяснения транспорта холестерина из транс-сети Гольджи к плазматической мембране. Более формально идея была развита в 1997 году Саймонсом и Иконеном. На симпозиуме Keystone по липидным рафтам и функциям клеток 2006 года липидные рафты были определены как «небольшие (10-200 нм), гетерогенные, высокодинамичные, обогащенные стеролом и сфинголипидом домены, которые разделяют клеточные процессы на компартменты. большие платформы за счет белок-белковых взаимодействий "В последние годы исследования липидных плотиков пытались решить многие из ключевых вопросов, вызывающих разногласия в этой области, включая размер и срок службы плотов.
Другие вопросы, на которые еще предстоит ответить:
Было предложено два типа липидных рафтов: плоские липидные рафты (также называемые некавеолярными или гликолипидными рафтами) и кавеолами. Плоские рафты определяются как непрерывные с плоскостью плазматической мембраны (не инвагинированные) и отсутствие отличительных морфологических особенностей. Кавеолы , с другой стороны, представляют собой инвагинации в форме колб на плазматической мембране, которые содержат белки кавеолин и являются наиболее часто наблюдаемыми структурами в липидных рафтах. Кавеолины широко экспрессируются в головном мозге, микрососудах нервной системы, эндотелиальных клетках, астроцитах, олигодендроцитах, шванновских клетках, ганглиях задних корешков и нейронах гиппокампа. Плоские рафты содержат белки флотилинов и обнаруживаются в нейронах, где кавеолы отсутствуют. Оба типа имеют схожий липидный состав (обогащены холестерином и сфинголипидами). Флотилин и кавеолины могут привлекать сигнальные молекулы в липидные рафты, тем самым играя важную роль в передаче сигнала нейромедиатора. Было высказано предположение, что эти микродомены пространственно организуют сигнальные молекулы, чтобы способствовать кинетически благоприятным взаимодействиям, которые необходимы для передачи сигнала. И наоборот, эти микродомены могут также разделять сигнальные молекулы, подавляя взаимодействия и подавляя сигнальные ответы.
Специфичность и точность передачи сигнала важны для того, чтобы клетки могли эффективно реагировать на изменения в их окружение. Частично это достигается за счет дифференциальной локализации белков, участвующих в сигнальных путях. В плазматической мембране один подход к компартментализации использует липидные рафты.
Один из разумных способов рассмотрения липидных рафтов состоит в том, что небольшие рафты могут образовывать концентрирующиеся платформы после активации связывания лиганда для индивидуальных рецепторов. Исследователи обнаружили, что липидные рафты участвуют во многих процессах передачи сигналов, таких как передача сигналов иммуноглобулина Е, передача сигналов рецептора антигена Т-клеток, передача сигналов рецептора антигена В-клеток, передача сигналов рецептора EGF, передача сигналов рецептора инсулина и так далее. Чтобы проиллюстрировать эти принципы, ниже описаны подробные примеры сигнальных путей, которые включают липидные рафты.
Фактор эпидермального роста (EGF) связывается с рецептором EGF, также известным как HER-1 или ErbB1, чтобы инициировать передачу трансмембранного сигнала. Было высказано предположение, что липидные рафты играют двоякую роль в этом процессе. Некоторые аспекты липидных рафтов ингибируют функцию рецептора EGF:
. липидные рафты, по-видимому, необходимы для трансмембранной передачи сигналов или усиливают ее:
Компоненты для передачи сигналов IgE 
Процесс передачи сигналов IgE Передача сигналов иммуноглобулина E (IgE) - это первые убедительно продемонстрированные липидные рафты, включающие процесс передачи сигналов. Доказательства этого факта включают снижение растворимости рецепторов Fc-эпсилон (FcεR) в Triton X-100 от устойчивого состояния до состояния сшивания, образование пятен, достаточно больших, чтобы их можно было визуализировать с помощью флуоресцентной микроскопии из ганглиозидов и GPI-закрепленных белки, отмена передачи сигналов IgE за счет истощения поверхностного холестерина метил-β-циклодекстрином и так далее. Этот сигнальный путь можно описать следующим образом: IgE сначала связывается с рецепторами Fc-эпсилон (FcεR), находящимися в плазматической мембране тучных клеток и базофилов, через свой Fc-сегмент. FcεR представляет собой тетрамер, состоящий из одной α, одной β и двух γ цепей. Он мономерный и связывает одну молекулу IgE. Цепь α связывает IgE, а три другие цепи содержат мотивы активации иммунного рецептора на основе тирозина (ITAM). Затем олигомерные антигены связываются с IgE, связанным с рецептором, сшивая два или более из этих рецепторов. Это сшивание затем привлекает дважды ацилированную нерецепторную Src-подобную тирозинкиназу Lyn для фосфорилирования ITAM. После этого тирозинкиназы семейства Syk связывают эти фосфотирозиновые остатки ITAM, чтобы инициировать сигнальный каскад. Syk, в свою очередь, может активировать другие белки, такие как LAT. Посредством перекрестного связывания LAT может привлекать другие белки к рафту и дополнительно усиливать сигнал.
Компоненты передачи сигнала рецептора антигена Т-клетки 
Процесс передачи сигнала рецептора антигена Т-клетки Рецептор Т-клеточного антигена (TCR) представляет собой молекулу, обнаруженную на поверхности Т-лимфоцитов (Т-клеток). Он состоит из αβ-гетеродимеров, комплекса CD3 (γδε) и ξ-гомодимера. Α- и β-субъединицы содержат внеклеточные сайты связывания для пептидов, которые представлены белками класса I и класса II главного комплекса гистосовместимости (MHC ) на поверхности антигенпрезентирующих клеток (APC). Субъединицы CD3 и ξ содержат цитоплазматические мотивы ITAM. Во время процесса передачи сигналов связывание MHC с TCR сближает два или более рецептора. Это перекрестное связывание, подобно передаче сигналов IgE, затем задействует дважды ацилированные нерецепторные Src-подобные тирозинкиназы для фосфорилирования тирозиновых остатков ITAM. Помимо рекрутирования Lyn, передача сигналов TCR также рекрутирует Fyn. После этой процедуры ZAP-70 (который также отличается от передачи сигналов IgE) связывается с фосфорилированными ITAM, что приводит к его собственной активации и активации LAT. Активация LAT является источником усиления сигнала. Другое различие между передачей сигналов рецептора антигена IgE и Т-клеток состоит в том, что активация Lck с помощью TCR может приводить к более тяжелой кластеризации рафтов, что приводит к большему усилению сигнала. Один из возможных механизмов подавления этой передачи сигналов включает связывание цитозольной киназы Csk с ассоциированным с рафтом белком CBP. Затем Csk может подавлять киназы семейства Src посредством фосфорилирования.
Рецептор B-клеточного антигена (BCR) представляет собой комплекс между молекулой связанного с мембраной Ig (mIg) и гетеродимер Igα-Igβ с дисульфидной связью двух полипептидов. Каждый из Igα и Igβ содержит аминокислотный мотив, называемый ITAM, последовательность которого D / ExxYxxL / Ix7YxxL / I.
Процесс передачи сигналов рецептора антигена B-клеток подобен передаче сигнала иммуноглобулина E и передаче сигнала рецептора антигена T-клетки. Обычно считается, что кроме BCR, липидные рафты играют важную роль во многих событиях на поверхности клетки, участвующих в активации B-клеток. Их функции включают передачу сигналов с помощью BCR, модуляцию этой передачи сигналов с помощью корецепторов, передачу сигналов с помощью CD40, эндоцитоз антигена, связанного с BCR, и его маршрутизацию к поздним эндосомам для облегчения загрузки пептидов, производных от антигена, на молекулы MHC класса II, маршрутизацию этих пептидов. комплексы пептид / MHC-II на поверхности клетки и их участие в презентации антигена Т-клеткам.
Вирусы, как облигатные внутриклеточные паразиты, должны вовлекать специфическое взаимодействие вируса и клеточного рецептора, экспрессируемого на плазматической мембране, чтобы проникнуть в клетки. Накопленные данные подтверждают, что вирусы проникают в клетки через проникновение определенных мембранных микродоменов, включая липидные рафты.
Наиболее изученными моделями необолочечного вируса, связанного с липидными рафтами, являются обезьяний вирус 40 (SV40, Papovaviridae) и эховирус типа 1 (EV1, Picornaviridae).
SV40 использует два разных рецептора для связывания с поверхностью клетки: ганглиозид GM1, расположенный в липидных рафтах, и молекулу класса I главной гистосовместимости (MHC). Связывание SV40 с молекулами MHC класса I запускает кластеризацию и перераспределение рецепторов. SV40 может привлекать больше кавеол из цитоплазмы или даже новые кавеолы, образующиеся в месте входа. Каскад вирусных сигнальных событий, запускаемых прикреплением, приводит к кавеолам-опосредованному эндоцитозу примерно через 20 минут. В некоторых типах клеток вирус может проникать в кавеосомы непосредственно из липидных рафтов в везикулах без покрытия.
EV1 использует α2β1-интегрин в качестве клеточного рецептора. Множественные гетеродимеры интегрина могут связываться с соседними участками капсида вируса. Подобно SV40, прикрепление и связывание с клетками запускает кластеризацию и перемещение молекул интегрина с липидных рафтов в кавеолоподобные структуры. Истощение запасов холестерина в липидных рафтах подавляет инфекцию EV1.
Существуют также вирусы, которые используют эндоцитоз, не опосредованный кавеолярным рафтом, такие как Echovirus 11 (EV11, пикорнавирус). Однако подробные механизмы все еще нуждаются в дальнейшем описании.
Вирусы гриппа связываются с сиаловой кислотой клеточного рецептора, которая связывается с гликоконъюгатом на поверхности клетки, чтобы инициировать эндоцитоз. После переноса в поздние эндосомы, зависимые от низкого pH конформационные изменения HA вызывают слияние, и вирусные рибонуклеопротеиновые комплексы (RNP) высвобождаются за счет притока протонов белков вирусного ионного канала M2, который требует связывания с холестерином. Вирусу леса Семлики (SFV) и вирусу Синдбис (SIN) требуются холестерин и сфинголипиды в липидных рафтах мембран-мишеней для опосредованного гликопротеином оболочки слияния и проникновения мембран. Человеческий Т-лимфотропный вирус типа I (HTLV-1) проникает в клетки через переносчик глюкозы 1 (GLUT-1). Вирус Эбола и вирус Марбург используют рецептор фолиевой кислоты-α (FRα), который является заякоренным белком GPI, в качестве клеточного рецептора. Вирус гепатита B распознает человеческий рецептор комплемента типа 2 (CR2, или известный как CD21). Человеческий герпесвирус 6 (HHV-6) связывается с человеческим CD46 на поверхности клетки-хозяина. Все эти вирусные рецепторы расположены в липидных рафтах или могут быть перемещены в липидные рафты после заражения.
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) как вирус животных, передающийся половым путем, должен сначала проникнуть через барьер эпителиальных клеток, которые не экспрессируют рецепторы CD4 и хемокинов, чтобы вызвать продуктивную инфекцию. Альтернативным рецептором гликопротеина оболочки ВИЧ-1 на эпителиальных клетках является гликосфинголипид галактозилцерамид (GalCer), который обогащается на липидном слое.
Одна из основных причин разногласий по поводу липидов. rafts возникла из-за проблем изучения липидных рафтов в живых клетках, которые не находятся в термодинамическом равновесии. Липидные рафты представляют собой небольшие микродомены размером от 10 до 200 нм. Из-за того, что их размер ниже классического дифракционного предела светового микроскопа, оказалось, что липидные рафты трудно визуализировать напрямую. В настоящее время изучаются синтетические мембраны; однако у этих мембран есть много недостатков. Во-первых, синтетические мембраны имеют более низкую концентрацию белков по сравнению с биомембранами. Кроме того, сложно смоделировать взаимодействия мембраны и цитоскелета, которые присутствуют в биомембранах. К другим подводным камням можно отнести отсутствие естественной асимметрии и невозможность изучения мембран в неравновесных условиях. Несмотря на это, флуоресцентная микроскопия широко используется в этой области. Например, широко используются флуорофоры, конъюгированные с B-субъединицей холерного токсина, которая связывается с составляющим рафта ганглиозидом GM1. Также используются липофильные мембранные красители, которые либо распределяются между рафтами и основной мембраной, либо изменяют свои флуоресцентные свойства в ответ на фазу мембраны. Лаурдан - один из ярких примеров такого красителя. Рафты также могут быть помечены генетической экспрессией флуоресцентных слитых белков, таких как Lck-GFP.
Манипуляция холестерином - один из наиболее широко используемых методов изучения липидных рафтов. Секвестрация (с использованием филипина, нистатина или амфотерицина), истощение и удаление (с использованием метил-B-циклодекстрина) и ингибирование синтеза холестерина (с использованием ингибиторов HMG-CoA-редуктазы) - это способы воздействия на холестерин в исследованиях липидных плотин. Эти исследования позволяют наблюдать влияние нейротрансмиттеров на передачу сигналов при снижении уровня холестерина.
Шарма и его коллеги использовали сочетание визуализации с высоким разрешением и математического моделирования, чтобы получить представление о том, что рафтовые белки организованы в нанокластеры высокой плотности с радиусами от 5 до 20 нм. Используя измерения резонансного переноса энергии флуоресценции между одними и теми же зондами (гомо-FRET или анизотропия флуоресценции), Шарма и его коллеги сообщили, что часть (20-40%) GPI-заякоренных белков организована в кластеры высокой плотности с радиусом 4-5 нм., каждая из которых состоит из нескольких молекул и различных GPI-заякоренных белков. Для решения проблем небольшого размера и динамического характера все большее значение приобретает слежение за отдельными частицами и молекулами с использованием охлаждаемых, чувствительных камер CCD и микроскопия полного внутреннего отражения (TIRF). Это позволяет извлекать информацию о коэффициенте диффузии частиц в мембране, а также выявлять загоны мембраны, барьеры и места удержания.
Также используются другие оптические методы: флуоресцентная корреляционная и кросс-корреляционная спектроскопия (FCS / FCCS) может использоваться для получения информации о подвижности флуорофора в мембране, передача энергии резонанса флуоресценции (FRET) может определять, когда флуорофоры находятся в непосредственной близости, а методы оптического пинцета могут дать информацию о вязкости мембраны.
Не только оптический методы, но также методы сканирующего зонда, такие как атомно-силовая микроскопия (АСМ) или сканирующая ионная проводимость (SICM), могут использоваться для обнаружения топологических и механических свойств синтетических липидов или нативных клеток мембраны, выделенные с помощью снятия кровли клеток.
Также используются интерферометрия с двойной поляризацией, ядерный магнитный резонанс (ЯМР), хотя флуоресцентная микроскопия остается доминирующим методом. Есть надежда, что в будущем микроскопия со сверхвысоким разрешением, такая как Stimulated Emission Depletion (STED) или различные формы микроскопии со структурированным освещением, сможет преодолеть проблемы, связанные с дифракционным пределом.
Другие методы, используемые в анализе липидных рафтов, включают ELISA, вестерн-блоттинг и FACS.
Роль рафтов в передаче сигналов, перемещении и структуре клеток имеет еще предстоит определить, несмотря на множество экспериментов, включающих несколько различных методов, и само их существование является спорным, несмотря на все вышесказанное.
Аргументы против существования липидных рафтов включают следующее:
Первое опровержение этого пункта предполагает, что Lo-фаза рафтов более плотно упакована из-за межмолекулярной водородной связи, проявляющейся между сфинголипидами и холестерином, которая не наблюдается в других местах.
Второй аргумент ставит под сомнение эффективность экспериментального плана при разрушении липидные рафты. Пайк и Миллер обсуждают возможные подводные камни использования истощения холестерина для определения функции липидного рафта. Они отметили, что большинство исследователей использовали острые методы истощения холестерина, которые разрушают рафты, но также разрушают другой липид, известный как PI (4,5) P 2. PI (4,5) P 2 играет большую роль в регуляции цитоскелета клетки, а нарушение PI (4,5) P 2 вызывает многие из те же результаты, что и этот тип истощения холестерина, включая латеральную диффузию белков в мембране. Поскольку эти методы разрушают и плоты, и PI (4,5) P 2, Kwik et al. пришли к выводу, что потеря определенной клеточной функции после истощения холестерина не обязательно может быть приписана исключительно разрушению липидного рафта, так как другие процессы, независимые от рафтов, также могут быть затронуты. Наконец, хотя считается, что липидные рафты каким-то образом связаны с белками, Эдидин утверждает, что белки привлекают липиды в рафте за счет взаимодействия белков с ацильными цепями липидов, а не наоборот.
 | На Викискладе есть средства массовой информации, связанные с Липидными рафтами. |
