Войти
Перенос микродиссекции с помощью лазера чистого протока груди эпителиальных клеток. Левая панель показывает срез ткани с удаленными выбранными клетками. На правой панели показаны изолированные эпителиальные клетки на трансферной пленке. Микродиссекция лазерного захвата (LCM ), также называемая микродиссекция, лазерная микродиссекция (LMD ), или микродиссекция с помощью лазера (LMD или LAM ), представляет собой метод выделения конкретных клеток интерес со стороны микроскопических участков ткани / клеток / организмов (рассечение в микроскопическом масштабе с помощью лазера ).
Микродиссекция с лазерным захватом ( LCM) - это метод получения субпопуляций тканевых клеток при прямой микроскопической визуализации. Технология LCM может собирать интересующие клетки напрямую или может изолировать определенные клетки, отсекая нежелательные клетки, чтобы получить гистологически чистые обогащенные популяции клеток. Существуют различные последующие приложения: генотипирование ДНК и анализ потери гетерозиготности (LOH), профилирование РНК-транскрипта, создание библиотеки кДНК, протеомика открытие и профилирование сигнальных путей. Общее время, необходимое для выполнения этого протокола, обычно составляет 1–1,5 ч.
A лазер подключается к микроскопу и фокусируется на ткани на предметном стекле. При перемещении лазера с помощью оптики или предметного столика фокус следует по траектории, заданной пользователем. Затем эта траектория, также называемая элементом, вырезается и отделяется от прилегающей ткани. После процесса резки должен следовать процесс экстракции, если требуется процесс экстракции. Более современные технологии используют бесконтактное микродиссектирование.
Существует несколько способов извлечения ткани из предметного стекла микроскопа с гистопатологическим образцом на нем. Прижмите липкую поверхность к образцу и вырвите. Это позволяет извлечь желаемую область, но также может удалить частицы или нежелательную ткань с поверхности, поскольку поверхность не является селективной. Расплавьте пластиковую мембрану на образец и вырвите ее. Тепло подводится, например, с помощью красного или инфракрасного (ИК) лазера к мембране, окрашенной поглощающим красителем. Поскольку при этом желаемый образец приклеивается к мембране, как и в случае любой мембраны, которая помещается близко к поверхности гистопатологического образца, может быть извлечен некоторый мусор. Другая опасность - это внесенное тепло: некоторые молекулы, такие как ДНК, РНК или белок, не позволяют нагреваться слишком сильно или вообще, чтобы их изолировать как можно более чисто.
Для бесконтактной транспортировки. Есть три разных подхода. Транспортировка под действием силы тяжести с использованием вертикального микроскопа (GAM, микродиссекция под действием силы тяжести ) или транспортировка с помощью катапульты с лазерным давлением; самое последнее поколение использует технологию, основанную на (LIFT). При использовании метода разрезания и захвата колпачок, покрытый адгезивом, помещается непосредственно на тонко разрезанный (5-8 мкм) срез ткани, сам срез опирается на тонкую мембрану (полиэтиленнафталин). ИК-лазер мягко нагревает клей на колпачке, сплавляя его с подлежащей тканью, а УФ-лазер прорезает ткань и подлежащую мембрану. Существо мембрана-ткань теперь прилипает к крышке, и клетки на крышке могут использоваться в последующих приложениях (ДНК, РНК, анализ белков).
Микродиссекция лазерного захвата Под микроскоп с помощью программного интерфейса просматривается срез ткани (обычно толщиной 5-50 микрометров), и отдельные клетки или кластеры клеток идентифицируются вручную, полуавтоматическими или более полностью автоматизированными способами, позволяющими визуализировать, а затем автоматический выбор целей для изоляции. В настоящее время существует шесть технологий первичной изоляции / сбора с использованием микроскопа и устройства для выделения клеток. В четырех из них обычно используется ультрафиолетовый импульсный лазер (355 нм) для резки тканей непосредственно или мембран / пленки, а иногда и в сочетании с лазером IR, отвечающим за нагрев / плавление липкого полимера для клеточного адгезия и изоляция. ИК-лазер обеспечивает более щадящий подход к микродиссекции. В пятой технологии, основанной на ультрафиолетовом лазере, используются специальные предметные стекла, покрытые энергетическим покрытием, которое при активации лазерным импульсом перемещает ткань или клетки в колпачок для сбора.
Ширина лазерной резки обычно меньше 1 мкм, поэтому лазерный луч не влияет на целевые клетки. Даже живые клетки не повреждаются при лазерной резке и становятся жизнеспособными после разрезания для клонирования и при необходимости повторного культивирования.
Различные технологии различаются процессом сбора, возможными методами визуализации (флуоресцентная микроскопия / микроскопия в светлом поле / дифференциальная интерференционная контрастная микроскопия / фазово-контрастная микроскопия / и т. Д.) И типы держателей и препараты ткани, необходимые перед визуализацией и выделением. Большинство из них - это в первую очередь специализированные системы микродиссекции, а некоторые могут использоваться в качестве исследовательских микроскопов, только одна технология (здесь №2, Leica) использует вертикальный микроскоп, что несколько ограничивает некоторые возможности обработки образцов, особенно для работы с живыми клетками.
Первая технология (использованная Carl Zeiss PALM) обрезает образец, а затем собирает его с помощью технологии «катапультирования». Образец может быть катапультирован со слайда или специальной чашки для культивирования с помощью расфокусированного лазерного импульса УФ, который генерирует фотонную силу для продвижения материала со слайда / чашки, метод, который иногда называют катапультированием под давлением лазерного микродиссекции (LMPC). Рассеченный материал направляется вверх (до нескольких миллиметров) в колпачок микроцентрифужной пробирки или другой коллектор, который содержит буфер или специальный липкий материал в колпачке пробирки, к которому ткань будет прилипать. Этот активный процесс катапультирования позволяет избежать некоторых статических проблем при использовании предметных стекол с мембранным покрытием.
Другой процесс основан на методе гравитационного микродиссекции, который включает гравитацию для сбора образцов в крышке пробирки под используемым предметным стеклом (используется Система ION LMD, Jungwoo FB). В случае этой системы он перемещает моторизованный столик, чтобы вырезать интересующие клетки, сохраняя лазерный луч на месте. В системе используется твердотельный лазер с длиной волны 355 нм (UV-A ), который является самым безопасным способом разрезания тканей без повреждения РНК или ДНК.
Другой тесно связанный процесс LCM (используемый Leica) разрезает образец сверху, и образец падает под действием силы тяжести (микродиссекция под действием силы тяжести) в устройство захвата под образцом. Точка, отличная от верхней, заключается в том, что здесь лазерный луч движется, чтобы разрезать ткань, перемещая дихроичное зеркало.
Когда выбранные клетки (на предметном стекле или специальной культуральной чашке) находятся в центре поля зрения, оператор выбирает интересующие клетки с помощью программного обеспечения прибора. Область, которая должна быть изолирована, когда лазер ближнего ИК-диапазона активирует переносящую пленку на колпачке, помещенном на образец ткани, расплавляя клей, который затем сплавляет пленку с выбранными подлежащими клетками (см. Системы Arcturus); и / или путем активации УФ-лазера для вырезания интересующей клетки. Затем клетки поднимаются с тонкого среза ткани, оставляя все нежелательные клетки. Затем интересующие клетки просматриваются и документируются перед экстракцией.
Четвертая технология на основе УФ (используемая Molecular Machines and Industries AG) предлагает небольшое отличие от третьей технологии здесь, по сути создавая своего рода бутерброд с слайд>образец>и мембрана, покрывающая образец, с помощью каркаса слайда, поверхность мембраны которого прорезается лазером и в конечном итоге захватывается сверху специальным липким колпачком.
В пятой технологии на основе УФ-излучения используется стандартное стекло слайды, покрытые инертным покрытием, передающим энергию, и системой лазерной микродиссекции на основе ультрафиолетового излучения (обычно это Leica LMD или PALM Zeiss). Срезы тканей устанавливаются поверх покрытия, передающего энергию. Энергия УФ-лазера преобразуется в кинетическую энергию при попадании на покрытие, испарении его и мгновенном перемещении выбранных элементов ткани в трубку для сбора. Слайды с покрытием, передающим энергию, выпускаемые под торговым названием DIRECTOR слайды компанией Expression Pathology Inc. (Роквилл, Мэриленд), предлагают несколько преимуществ для протеомной работы. Они также не обладают автофлуоресценцией, поэтому их можно использовать для применений с использованием флуоресцентных красителей, ДИК или поляризованного света.
Помимо срезов тканей, LCM можно проводить на живых клетках / организмах, мазках клеток, препаратах хромосом, и растительная ткань.
Процесс микродиссекции с помощью лазерного захвата не изменяет и не повреждает морфологию и химический состав собранных образцов, а также окружающие клетки. По этой причине LCM является полезным методом сбора выбранных клеток для анализов ДНК, РНК и / или белка. LCM также использовался для выделения бесклеточных структур, таких как амилоидные бляшки. LCM можно проводить на различных образцах ткани, включая мазки крови, цитологические препараты, культуры клеток и аликвоты твердых тканей. Также можно использовать замороженную и залитую парафином архивную ткань.
