Войти
Этот рисунок иллюстрирует основной принцип, лежащий в основе прыгающих библиотек. Стрелки представляют две физически удаленные последовательности, которые сближаются с помощью этого метода. Библиотеки переходов или библиотеки соединительных фрагментов - это коллекции фрагментов геномной ДНК, генерируемые скачками хромосом. Эти библиотеки позволяют анализировать большие области генома и преодолевать ограничения расстояния в обычных методах клонирования. Клон прыгающей библиотеки состоит из двух участков ДНК, которые обычно расположены на расстоянии многих килобаз друг от друга. Участок ДНК, расположенный между этими двумя «концами», удаляется серией биохимических манипуляций, проводимых в начале этой техники клонирования.
Перескок хромосом (или скачок хромосом) был впервые описан в 1984 году Коллинзом и Вайсманом. В то время методы клонирования позволяли создавать клоны ограниченного размера (до 240 килобайт), а цитогенетические методы позволяли картировать такие клоны на небольшой участок конкретной хромосомы с разрешением около 5-10 Мб. Таким образом, оставался большой разрыв в разрешении между доступными технологиями, и не было доступных методов для картирования больших участков генома.
Этот рисунок представляет собой схематическое представление метода, использованного для создания прыгающих библиотек, когда он был первоначально разработан в 80-х годах. Этот метод является продолжением «хромосомного хождения», позволяющим делать большие «шаги» по хромосоме. Если желательны ступени длиной N kb, необходима ДНК с очень высокой молекулярной массой. После выделения он частично переваривается рестриктазой (например, MboI или BamHI ). Затем полученные фрагменты отбираются по размеру, который должен составлять около N kb. Затем ДНК необходимо лигировать при низкой концентрации, чтобы способствовать лигированию в круги, а не формированию мультимеров. Маркер ДНК (такой как ген супрессора янтарной тРНК supF) может быть включен в этот момент времени в ковалентно связанный круг, чтобы сделать возможным выбор фрагментов соединения. Затем круги полностью перевариваются вторым рестрикционным ферментом (таким как EcoRI ) с образованием большого количества фрагментов. Такие фрагменты лигируют в векторы (такие как вектор λ), которые следует выбирать для использования ранее введенного маркера ДНК. Остальные фрагменты, таким образом, представляют собой библиотеку соединительных фрагментов или «библиотеку прыжков». Следующим шагом является скрининг этой библиотеки с помощью зонда, который представляет «отправную точку» желаемого «хромосомного скачка», то есть определение местоположения генома, который подвергается опросу. Клоны, полученные на этом последнем этапе отбора, будут состоять из ДНК, гомологичной нашему зонду, отделенной нашим ДНК-маркером от другой последовательности ДНК, которая изначально была расположена на расстоянии N kb (таким образом, называемая «прыгающей»). Путем создания нескольких библиотек с разными значениями N можно в конечном итоге нанести на карту весь геном, позволяя перемещаться из одного места в другое, контролируя направление, с любым желаемым значением N.
Оригинальная техника прыжка хромосом была разработана в лабораториях Коллинза и Вайсмана в Йельском университете в Нью-Хейвене, США, и лабораториях Поустки и Лехраха в Европейской лаборатории молекулярной биологии в Гейдельберге, Германия.
Описанный выше метод Коллинза и Вайсмана столкнулся с некоторыми ранними ограничениями. Основная проблема заключалась в том, чтобы избежать некруглых фрагментов. Было предложено два решения: либо скрининг соединительных фрагментов с заданным зондом, либо добавление второй стадии отбора по размеру после лигирования для отделения одиночных кольцевых клонов (мономеров) от клонов, лигированных друг с другом (мультимеры). Авторы также предположили, что следует учитывать другие маркеры, такие как сайт λ cos или гены устойчивости к антибиотикам (вместо гена тРНК-супрессора янтаря) для облегчения отбора клонов соединений.
Poustka и Lehrach предположили, что полное переваривание с редкими ограничивающими ферментами (такими как NotI) должно использоваться на первом этапе построения библиотеки вместо частичного переваривания с часто разрезающим ферментом рестрикции. Это значительно сократит количество клонов с миллионов до тысяч. Однако это может создать проблемы с циркуляризацией фрагментов ДНК, поскольку эти фрагменты будут очень длинными, а также потеряют гибкость в выборе конечных точек, которую можно получить при частичном переваривании. Одним из предложений по преодолению этих проблем было бы объединение двух методов, то есть создание прыгающей библиотеки из фрагментов ДНК, частично переваренных с помощью обычно расщепляющего рестрикционного фермента и полностью с помощью редкого режущего рестрикционного фермента, и превращение их в циркулярную форму в плазмиды, расщепленные обоими ферментами. Несколько из этих "комбинированных" библиотек были завершены в 1986 году.
В 1991 г. Забаровский и др. предложил новый подход к построению прыгающих библиотек. Этот подход включал использование двух отдельных λ-векторов для построения библиотеки и реакцию частичного заполнения, которая устраняет необходимость в селектируемом маркере. Эта реакция заполнения работала за счет разрушения определенных когезионных концов (возникающих в результате рестрикционного переваривания) фрагментов ДНК, которые не были лигированы и не подвергались циркуляции, тем самым предотвращая их клонирование в векторы более энергоэффективным и точным образом. Кроме того, этот улучшенный метод потребовал меньше ДНК для начала, а также произвел библиотеку, которую можно было преобразовать в плазмидную форму, что облегчило ее хранение и репликацию. Используя этот новый подход, они успешно сконструировали библиотеку прыжков NotI человека из линии лимфобластоидных клеток и библиотеку прыжков NotI, специфичную для хромосомы 3 человека, из линии гибридных клеток хромосомы 3 человека и мыши.
Методы второго поколения или «следующего поколения» (NGS) радикально эволюционировали: возможности секвенирования увеличились более чем в десять тысяч раз, а стоимость упала более чем в миллион раз с 2007 года (Национальный исследовательский институт генома человека). NGS произвела революцию в области генетики во многих отношениях.
Библиотеку часто получают путем случайной фрагментации ДНК и лигирования общих последовательностей адаптеров. Однако сгенерированные короткие чтения затрудняют идентификацию структурных вариантов, таких как инделки, транслокации и дупликации. Большие области простых повторов могут еще больше усложнить выравнивание. В качестве альтернативы, с NGS можно использовать прыгающую библиотеку для отображения структурных вариаций и строительных лесов сборок de novo.
Этот рисунок представляет собой схематическое изображение одного из последних использовавшихся методов создания прыгающих библиотек. Прыгающие библиотеки можно разделить на категории по длине встроенных фрагментов ДНК.
В библиотеке с коротким прыжком фрагменты геномной ДНК размером 3 т.п.н. лигируют с биотинилатными концами и подвергают циркуляризации. Затем круглые сегменты разрезают на небольшие фрагменты, и биотинилированные фрагменты отбирают с помощью анализа аффинности для секвенирования парных концов.
Есть две проблемы, связанные с библиотеками коротких прыжков. Во-первых, считывание может проходить через биотинилированный переход циркуляризации и уменьшать эффективную длину считывания. Во-вторых, чтения из неперескоченных фрагментов (то есть фрагментов без кольцевого соединения) секвенируются и уменьшают геномный охват. Сообщалось, что фрагменты без перескока варьируются от 4% до 13%, в зависимости от размера выделения. Первую проблему можно решить, разрезая круги на больший размер и выбрав для них более крупные фрагменты. Вторую проблему можно решить с помощью специальной библиотеки прыжков со штрих-кодом.
Эта библиотека перехода использует адаптеры, содержащие маркеры для выбора фрагментов в сочетании со штрих-кодами для мультиплексирования. Протокол был разработан Talkowski et al. и основан на подготовке библиотеки пар пары для секвенирования SOLiD. Размер выбранного фрагмента ДНК составляет 3,5 - 4,5 т.п.н. Были задействованы два адаптера: один, содержащий сайт распознавания EcoP15I и выступ AC; другой содержит выступ GT, биотинилированный тимин и олиго-штрих-код. Циркуляризованная ДНК была переварена, и были отобраны фрагменты с биотинилированными адаптерами (см. Рисунок 3). Сайт распознавания EcoP15I и штрих-код помогают отличить фрагменты соединения от фрагментов без перескока. Эти целевые фрагменты должны содержать от 25 до 27 пар оснований геномной ДНК, сайт узнавания EcoP15I, выступ и штрих-код.
Этот процесс создания библиотеки аналогичен процессу создания библиотеки с коротким переходом, за исключением того, что условие оптимизировано для более длинных фрагментов (5 кб).
Этот процесс построения библиотеки также аналогичен процессу создания библиотеки с коротким переходом, за исключением того, что трансфекция с использованием вектора E. coli требуется для амплификации больших (40 т.п.н.) фрагментов ДНК. Кроме того, фосмиды можно модифицировать, чтобы облегчить преобразование в прыгающую библиотеку, совместимую с определенными секвенсорами следующего поколения.
Сегменты, полученные в результате циркуляризации во время конструирования прыгающей библиотеки, расщепляются, а фрагменты ДНК с маркерами будут обогащены и подвергнуты секвенированию по парным концам. Эти фрагменты ДНК секвенируются с обоих концов и генерируют пары считываний. Геномное расстояние между чтениями в каждой паре приблизительно известно и используется для процесса сборки. Например, клон ДНК, созданный случайной фрагментацией, имеет длину около 200 п.н., а считывание с каждого конца составляет около 180 п.н., перекрывая друг друга. Это следует отличать от секвенирования пары спариваний, которое в основном представляет собой комбинацию секвенирования следующего поколения с библиотеками прыжков.
Для обработки данных библиотеки скачков были разработаны различные инструменты сборки. Один из примеров - ДЕЛЛИ. DELLY был разработан для обнаружения структурных вариантов генома и «объединяет короткие вставки с парными концами, дальнодействующие пары спаривания и выравнивания с разделенным считыванием» для обнаружения реаранжировок на уровне последовательностей.
Пример совместной разработки нового экспериментального дизайна и разработки алгоритма демонстрирует ассемблер ALLPATHS-LG.
При использовании для обнаружения генетических и геномных изменений прыгающие клоны требуют проверки секвенированием по Сэнгеру.
В первые дни хромосомный ход от генетически связанных ДНК-маркеров использовался для идентификации и клонирования генов болезней. Однако большое молекулярное расстояние между известными маркерами и интересующим геном усложняло процесс клонирования. В 1987 году была сконструирована библиотека скачков хромосом человека для клонирования гена кистозного фиброза. Муковисцидоз - аутосомно-рецессивное заболевание, которым страдает 1 человек из 2000 европеоидной расы. Это была первая болезнь, при которой была продемонстрирована полезность прыгающих библиотек. Онкоген Met был маркером, прочно связанным с геном муковисцидоза на хромосоме 7 человека, и библиотеку проверяли на наличие прыгающего клона, начинающегося с этого маркера. Было установлено, что ген кистозного фиброза локализован на 240 килобайт ниже гена met. Перепрыгивание хромосом помогло сократить «шаги» картирования и обойти очень повторяющиеся области в геноме млекопитающих. Прыжки хромосом также позволили получить зонды, необходимые для более быстрой диагностики этого и других заболеваний.
Сбалансированные хромосомные перестройки могут вносить значительный вклад в развитие заболеваний, как показали исследования лейкемии. Однако многие из них не обнаруживаются хромосомным микрочипом. Кариотипирование и FISH могут идентифицировать сбалансированные транслокации и инверсии, но они трудоемки и обеспечивают низкое разрешение (небольшие геномные изменения пропускаются).
Комбинированный подход NGS с прыгающей библиотекой может быть применен для выявления таких геномных изменений. Например, Slade et al. применил этот метод для точного картирования сбалансированной de novo транслокации у ребенка с опухолью Вильмса. Для этого исследования было произведено 50 миллионов считываний, но только 11,6% из них можно было сопоставить однозначно с эталонным геномом, что составляет примерно шестикратный охват.
Talkowski et al. сравнили различные подходы к обнаружению сбалансированных хромосомных изменений и показали, что модифицированная прыгающая библиотека в сочетании с секвенированием ДНК следующего поколения является точным методом картирования хромосомных точек разрыва. Были протестированы две разновидности библиотек прыжков (библиотеки коротких прыжков и пользовательские библиотеки прыжков со штрих-кодом) и сравнивались со стандартными библиотеками секвенирования. Для стандартного NGS генерируются фрагменты размером 200-500 пар оснований. Около 0,03–0,54% фрагментов представляют собой химерные пары, которые представляют собой пары концевых считываний, которые картированы в двух разных хромосомах. Поэтому очень мало фрагментов покрывают область точки останова. При использовании библиотек коротких прыжков с фрагментами 3,2–3,8kb процент химерных пар увеличивался до 1,3%. Благодаря пользовательским библиотекам прыжков со штрих-кодами процент химерных пар увеличился до 1,49%.
Обычное цитогенетическое тестирование не может предложить разрешение на уровне генов, необходимое для прогнозирования исхода беременности, а глубокое секвенирование всего генома нецелесообразно для рутинной пренатальной диагностики. Прыжковая библиотека полного генома может дополнить обычное пренатальное тестирование. Этот новый метод был успешно применен для выявления случая синдрома ЗАРЯДА.
В метагеномике области генома, общие для разных штаммов, обычно длиннее, чем считываемые. Это усложняет процесс сборки и делает восстановление отдельных геномов вида сложной задачей. Химерные пары, которые картированы далеко друг от друга в геноме, могут способствовать процессу сборки de novo. Используя библиотеку прыжков в длину, Ribeiro et al. продемонстрировали, что сборки бактериальных геномов были высокого качества при одновременном сокращении затрат и времени.
Стоимость секвенирования резко упала, в то время как стоимость создания прыгающих библиотек - нет. Следовательно, по мере развития новых технологий секвенирования и биоинформатических инструментов прыгающие библиотеки могут стать излишними.
