Аффинити-тег, закодированный изотопом

Изотоп-кодированная аффинная метка ( МЦКИ ) является в пробирке изотопного мечения метод, используемые для количественной протеомики с помощью масс - спектрометрии, который использует химические маркировки реагентов. Эти химические зонды состоят из трех элементов: реактивной группы для мечения боковой цепи аминокислоты (например, йодацетамида для модификации остатков цистеина), изотопно кодированного линкера и метки (например, биотина ) для аффинного выделения меченых белков / пептидов.. Образцы объединяют и затем разделяют с помощью хроматографии, затем отправляют через масс-спектрометр для определения отношения массы к заряду между белками. Можно анализировать только цистеинсодержащие пептиды. Поскольку анализируются только цистеинсодержащие пептиды, часто посттрансляционная модификация теряется.

Первоначальные метки были разработаны с использованием дейтерия, но позже та же группа переработала метки, используя вместо этого 13C, чтобы обойти проблемы разделения пиков во время жидкостной хроматографии из-за взаимодействия дейтерия со стационарной фазой колонки.

Для количественного сравнения двух протеомов один образец метят изотопически легким (d0) зондом, а другой - изотопически тяжелой (d8) версией. Чтобы свести к минимуму ошибку, оба образца затем объединяют, обрабатывают протеазой (например, трипсином ) и подвергают авидиновой аффинной хроматографии для выделения пептидов, меченных изотопно-кодирующими реагентами для мечения. Затем эти пептиды анализируют с помощью жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС). Для определения относительных уровней белков в двух образцах количественно оценивают отношения интенсивностей сигналов пар пептидов с разной массой.