Войти
Секвенирование ионных полупроводников - это метод Секвенирование ДНК, основанное на обнаружении ионов водорода, которые высвобождаются в ходе полимеризации ДНК. Это метод «секвенирования путем синтеза», в ходе которого комплементарная цепь строится на основе последовательности матричной цепи.
Полупроводниковый секвенатор Ion Proton Микролунка, содержащая матричную цепь ДНК, подлежащую секвенированию, заполняется одним видом дезоксирибонуклеотидтрифосфата (dNTP). Если введенный dNTP комплементарен ведущему нуклеотиду матрицы, он включается в растущую комплементарную цепь. Это вызывает высвобождение иона водорода, который запускает ионный датчик ISFET, что указывает на то, что произошла реакция. Если в матричной последовательности присутствуют гомополимерные повторы, несколько молекул dNTP будут включены в один цикл. Это приводит к соответствующему количеству высвобождаемых водородов и пропорционально более высокому электронному сигналу.
Эта технология отличается от других технологий секвенирования путем синтеза тем, что не используются модифицированные нуклеотиды или оптика. Ионно-полупроводниковое секвенирование может также называться секвенированием ионного потока, pH-опосредованным секвенированием, кремниевым секвенированием или полупроводниковым секвенированием.
Технология была лицензирована DNA Electronics Ltd, разработана Ion Torrent Systems Inc. и была выпущена в феврале 2010 года. Ion Torrent продавала свои как быстрый, компактный и экономичный секвенсор, который можно использовать в большом количестве лабораторий в качестве настольного устройства. Компания Roche 454 Life Sciences сотрудничает с DNA Electronics в разработке платформы для долгого считывания полупроводников с высокой плотностью записи с использованием этой технологии.
Включение дезоксирибонуклеотидтрифосфата в растущая цепь ДНК вызывает высвобождение водорода и пирофосфата. 
Высвобождение ионов водорода указывает на включение нуля, одного или нескольких нуклеотидов. 
Высвобожденные ионы водорода обнаруживаются ионным датчиком. Множественные включения приводят к соответствующему количеству высвобождаемых водородов и интенсивности сигнала. В природе включение дезоксирибонуклеозидтрифосфата (dNTP) в растущую цепь ДНК включает образование ковалентной связи и высвобождение пирофосфата и положительно заряженного иона водорода. DNTP будет включен, только если он комплементарен ведущему неспаренному матричному нуклеотиду. Ионно-полупроводниковое секвенирование использует эти факты, определяя, высвобождается ли ион водорода при введении в реакцию одного вида dNTP.
Микролунки на полупроводниковом чипе, каждая из которых содержит множество копий одной одноцепочечной матричной молекулы ДНК для секвенирования, и ДНК-полимеразы последовательно заполняются немодифицированными A, C, G или T dNTP. Если введенный dNTP комплементарен следующему неспаренному нуклеотиду на матричной цепи, он включается в растущую комплементарную цепь ДНК-полимеразой. Если введенный dNTP не является комплементарным, не происходит включения и биохимической реакции. Ион водорода, который высвобождается в результате реакции, изменяет pH раствора, что определяется с помощью ISFET. Неприкрепленные молекулы dNTP вымываются перед следующим циклом, когда вводится другой вид dNTP.
Под слоем микролунок находится ионно-чувствительный слой, ниже которого находится ISFET ионный датчик. Все слои содержатся в полупроводниковом кристалле CMOS, аналогичном тому, который используется в электронной промышленности.
Каждый чип содержит массив микролунок с соответствующими детекторами ISFET. Затем каждый высвобожденный ион водорода запускает ионный датчик ISFET. Последовательность электрических импульсов, передаваемых от чипа к компьютеру, преобразуется в последовательность ДНК без необходимости в промежуточном преобразовании сигнала. Поскольку события включения нуклеотидов измеряются непосредственно электроникой, использование меченых нуклеотидов и оптических измерений избегается. Затем обработка сигналов и сборка ДНК могут выполняться с помощью программного обеспечения.
Базовая точность, достигнутая компанией Ion Torrent на Ion Torrent Ion Semiconductor Sequencer по состоянию на февраль 2011 г., составила 99,6% на основе 50 base читает со 100 Мб за запуск. Длина чтения по состоянию на февраль 2011 г. составляла 100 пар оснований. Точность для гомополимерных повторов длиной 5 повторов составила 98%. Более поздние версии показывают, что длина чтения составляет 400 пар оснований. Эти цифры еще не подвергались независимой проверке вне компании.
Основными преимуществами ионно-полупроводникового секвенирования являются высокая скорость секвенирования и низкие первоначальные и эксплуатационные расходы. Это стало возможным благодаря отказу от модифицированных нуклеотидов и оптических измерений.
Поскольку система регистрирует события включения нуклеотидов, опосредованные естественной полимеразой, секвенирование может происходить в режиме реального времени. На самом деле скорость секвенирования ограничивается циклическим перемещением нуклеотидов субстрата через систему. Разработчик технологии Ion Torrent Systems Inc. утверждает, что каждое измерение включения занимает 4 секунды, а каждый запуск занимает около часа, в течение которого секвенируются 100-200 нуклеотидов. Если полупроводниковые чипы будут улучшены (как предсказано законом Мура ), количество считываний на чип (и, следовательно, на цикл) должно увеличиться.
Стоимость приобретения pH-опосредованного секвенатора от Ion Torrent Systems Inc. на момент запуска была оценена примерно в 50 000 долларов США, без учета оборудования для подготовки проб и сервера для анализа данных. Стоимость одного цикла также значительно ниже, чем у альтернативных методов автоматического секвенирования, примерно 1000 долларов США.
Если гомополимер повторы одного и того же нуклеотида (например, TTTTT) присутствуют на матричной цепи (цепь, которая должна быть секвенирована), затем встраиваются несколько введенных нуклеотидов и больше ионов водорода высвобождается за один цикл. Это приводит к большему изменению pH и пропорционально большему электронному сигналу. Это ограничение системы в том, что трудно перечислить длинные повторы. Это ограничение характерно для других методов, которые обнаруживают добавление одиночных нуклеотидов, таких как пиросеквенирование. Сигналы, генерируемые большим числом повторов, трудно отличить от повторов схожего, но другого числа; например, гомореповторы длиной 7 трудно отличить от гомореповторов длиной 8.
Еще одним ограничением этой системы является малая длина считывания по сравнению с другими методами секвенирования, такими как секвенирование по Сэнгеру или пиросеквенирование. Большая длина чтения полезна для de novo сборки генома. Полупроводниковые секвенаторы Ion Torrent производят среднюю длину чтения приблизительно 400 нуклеотидов на одно чтение.
Пропускная способность в настоящее время ниже, чем у других технологий высокопроизводительного секвенирования, хотя разработчики надеются изменить это за счет увеличения плотности чипа.
Разработчики полупроводникового секвенирования Ion Torrent представили его как быстрый, компактный и экономичный секвенсор, который можно использовать в большом количестве лабораторий в качестве настольная машина. Компания надеется, что их система перенесет секвенирование за пределы специализированных центров в больницы и небольшие лаборатории. В статье New York Times, опубликованной в январе 2011 года, «Распространение секвенирования ДНК», подчеркиваются эти амбиции.
Благодаря способности альтернативных методов секвенирования достичь большая длина считывания (и, следовательно, более подходящая для анализа всего генома ), эта технология может лучше всего подходить для небольших приложений, таких как микробное секвенирование генома, микробный транскриптом секвенирование, целевое секвенирование, секвенирование ампликона или для проверки качества библиотек секвенирования.
