Иммунофлуоресценция - это метод, используемый для световой микроскопии с флуоресцентный микроскоп и используется в основном для микробиологических образцов. Этот метод использует специфичность антител к их антигену для нацеливания флуоресцентных красителей на специфические биомолекулы в пределах ячейка, и, следовательно, позволяет визуализировать распределение целевой молекулы в образце. Специфическая область, которую антитело распознает на антигене, называется эпитопом. Были предприняты попытки картирования эпитопов, поскольку многие антитела могут связывать один и тот же эпитоп, и уровни связывания между антителами, распознающими один и тот же эпитоп, могут варьироваться. Кроме того, связывание флуорофора с антителом не может влиять на иммунологическую специфичность антитела или связывающую способность его антигена. Иммунофлуоресценция - это широко используемый пример иммуноокрашивания (с использованием антител для окрашивания белков) и конкретный пример иммуногистохимии (использование взаимосвязи антитело-антиген в тканях). В этом методе в первую очередь используются флуорофоры для визуализации местоположения антител.
Иммунофлуоресценцию можно использовать на срезах тканей, культивируемых клеточных линиях или отдельных клетках, а также можно использовать для анализа распределение белков, гликанов и небольших биологических и небиологических молекул. Этот метод можно использовать даже для визуализации таких структур, как волокна среднего размера. Если топология клеточной мембраны еще не определена, вставку эпитопа в белки можно использовать в сочетании с иммунофлуоресценцией для определения структур. Иммунофлуоресценция также может использоваться как «полуколичественный» метод для понимания уровней и моделей локализации метилирования ДНК, поскольку это более трудоемкий метод, чем истинные количественные методы, и есть некоторая субъективность в анализе уровней метилирование. Иммунофлуоресценцию можно использовать в сочетании с другими методами флуоресцентного окрашивания, не связанными с антителами, например, с использованием DAPI для метки ДНК. Для анализа иммунофлуоресцентных образцов можно использовать несколько конструкций микроскопов; Самым простым является эпифлуоресцентный микроскоп , также широко используется конфокальный микроскоп . Также можно использовать различные конструкции микроскопов сверхвысокого разрешения, которые обеспечивают гораздо более высокое разрешение.
Для получения антител, меченных флуорохромом, флуорохром должен быть конъюгирован («помечен ") к антителу. Точно так же антиген также может быть конъюгирован с антителом с помощью флуоресцентного зонда с помощью метода, называемого методом флуоресцентного антигена. Процедуры окрашивания могут применяться как к фиксированным антигенам в цитоплазме, так и к антигенам клеточной поверхности живых клеток, что называется «иммунофлуоресценцией мембраны». Также возможно пометить комплемент комплекса антитело-антиген с помощью флуоресцентного зонда. В дополнение к элементу, к которому прикреплены флуоресцентные зонды, существует два основных класса иммунофлуоресцентных методов: первичные и вторичные. Следующие ниже описания будут сосредоточены в первую очередь на этих классах с точки зрения конъюгированных антител.
Существует два класса иммунофлуоресцентных методов: первичные (или прямые) и вторичные (или непрямые).
Первичная (прямая) иммунофлуоресценция использует одно первичное антитело, химически связанное с флуорофором. Первичное антитело распознает целевую молекулу (антиген) и связывается с определенной областью, называемой эпитопом. Это достигается с помощью процесса, который управляет иммунным ответом организма с помощью адаптивного иммунитета. Присоединенный флуорофор можно обнаружить с помощью флуоресцентной микроскопии, которая, в зависимости от используемого мессенджера, при возбуждении будет излучать свет определенной длины волны. Прямая иммунофлуоресценция, хотя и несколько реже, имеет заметные преимущества перед вторичной (непрямой) процедурой. Прямое прикрепление мессенджера к антителу сокращает количество этапов процедуры, экономя время и уменьшая неспецифический фоновый сигнал. Это также ограничивает возможность перекрестной реактивности антител и возможных ошибок на протяжении всего процесса. Однако у этого метода есть некоторые недостатки. Поскольку количество флуоресцентных молекул, которые могут быть связаны с первичным антителом, ограничено, прямая иммунофлуоресценция существенно менее чувствительна, чем непрямая иммунофлуоресценция, и может давать ложноотрицательные результаты. Прямая иммунофлуоресценция также требует использования гораздо большего количества первичных антител, что чрезвычайно дорого, иногда до 400 долларов за мл.
Вторичная (непрямая) иммунофлуоресценция использует два антитела; немеченое первое (первичное) антитело специфически связывает молекулу-мишень, а вторичное антитело, несущее флуорофор, распознает первичное антитело и связывается с ним. Множественные вторичные антитела могут связывать одно первичное антитело. Это обеспечивает усиление сигнала за счет увеличения количества молекул флуорофора на антиген. Этот протокол является более сложным и трудоемким, чем описанный выше первичный (или прямой) протокол, но обеспечивает большую гибкость, поскольку для данного первичного антитела можно использовать множество различных вторичных антител и методов обнаружения.
Этот протокол возможно, потому что антитело состоит из двух частей: вариабельной области (которая распознает антиген) и константной области (которая составляет структуру молекулы антитела). Важно понимать, что это деление является искусственным, и на самом деле молекула антитела состоит из четырех полипептидных цепей: двух тяжелых цепей и двух легких цепей. Исследователь может создать несколько первичных антител, которые распознают различные антигены (имеют разные вариабельные области), но все имеют одну и ту же константную область. Следовательно, все эти антитела могут распознаваться одним вторичным антителом. Это экономит затраты на модификацию первичных антител для прямого переноса флуорофора.
Различные первичные антитела с разными константными областями обычно получают путем повышения уровня антител у разных видов. Например, исследователь может создать у козы первичные антитела, которые распознают несколько антигенов, а затем использовать связанные с красителем вторичные антитела кролика, которые распознают константную область козьих антител («кроличьи антикозьи» антитела). Затем исследователь может создать второй набор первичных антител у мыши, который может распознаваться отдельным вторичным антителом «ослиные антимышиные». Это позволяет повторно использовать сложные для изготовления антитела, связанные с красителем, в нескольких экспериментах.
Как и в случае с большинством флуоресцентных методов, существенной проблемой иммунофлуоресценции является фотообесцвечивание. Снижение активности, вызванное фотообесцвечиванием, можно контролировать, уменьшая или ограничивая интенсивность или продолжительность воздействия света, увеличивая концентрацию флуорофоров или используя более надежные флуорофоры, которые менее склонны к обесцвечиванию (например, Alexa Fluors, Seta Fluors или DyLight Fluors ). Некоторые проблемы, которые могут возникнуть при использовании этого метода, включают автофлуоресценцию, постороннюю нежелательную специфическую флуоресценцию и неспецифическую флуоресценцию. Автофлуоресценция включает флуоресценцию, испускаемую самой тканью или клеткой образца. Посторонняя нежелательная специфическая флуоресценция возникает, когда целевой антиген не чистый и содержит антигенные примеси. Неспецифическая флуоресценция включает потерю специфичности зонда из-за флуорофора, из-за неправильной фиксации или из-за высохшего образца.
Иммунофлуоресценция ограничивается только фиксированными (т. Е. Мертвыми) клетками, когда структуры внутри клетки должны быть визуализируется, потому что антитела не проникают через клеточную мембрану при реакции с флуоресцентными метками. Антигенный материал должен быть прочно закреплен на месте его естественной локализации внутри клетки. Интактные антитела также могут быть слишком большими, чтобы окрашивать раковые клетки in vivo. Их размер приводит к медленному проникновению в опухоль и длительному периоду полураспада. Было проведено исследование использования диател для обхода этого ограничения. Белки в супернатанте или вне клеточной мембраны могут связываться антителами; это позволяет окрашивать живые клетки. В зависимости от используемого фиксатора, представляющие интерес белки могут стать перекрестно-связанными, и это может привести к ложноположительным или ложноотрицательным сигналам из-за неспецифического связывания.
Альтернативный подход заключается в использовании рекомбинантных белков, содержащих домены флуоресцентных белков, например, зеленый флуоресцентный белок (GFP). Использование таких «меченых» белков позволяет определить их локализацию в живых клетках. Несмотря на то, что это кажется изящной альтернативой иммунофлуоресценции, клетки необходимо трансфицировать или трансдуцировать с помощью GFP-метки, и, как следствие, они становятся как минимум S1 или выше организмами, которые требуют более строгих стандартов безопасности в лаборатории. Этот метод включает изменение генетической информации клеток.
Многие улучшения этого метода заключаются в улучшении флуоресцентных микроскопов и флуорофоров. Методы сверхвысокого разрешения обычно относятся к способности микроскопа обеспечивать разрешение ниже предела Аббе (предел, налагаемый на свет из-за его длины волны). Этот дифракционный предел составляет около 200-300 нм в поперечном направлении и 500-700 нм в осевом направлении. Этот предел сопоставим или больше, чем у некоторых структур в клетке, и, следовательно, этот предел не позволял ученым определить детали их структуры. Более конкретно, сверхразрешение флуоресценции относится к способности микроскопа предотвращать одновременную флуоресценцию соседних спектрально идентичных флуорофоров. Этот процесс эффективно улучшает функцию рассеяния точки микроскопа. Примеры недавно разработанных методов флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения включают микроскопию истощения с помощью стимулированного излучения (STED), микроскопию с насыщенным структурированным освещением (SSIM), микроскопию локализации флуоресцентной фотоактивации (FPALM) и микроскопию стохастической оптической реконструкции (STORM).