Войти
In vitro тестирование токсичности - это научный анализ воздействия токсичных химических веществ на культивируемые бактерии или клетки млекопитающих. Методы тестирования in vitro (буквально «в стекле») используются в первую очередь для выявления потенциально опасных химических веществ и / или подтверждения отсутствия определенных токсических свойств на ранних этапах разработки потенциально полезных новых веществ, таких как лечебные лекарственные препараты, сельскохозяйственные химические вещества и пищевые добавки.
Исследования токсичности ксенобиотиков in vitro в последнее время тщательно рассматриваются ключевыми государственными учреждениями (например, EPA; NIEHS / NTP; FDA), чтобы лучше оценить риски для человека. Существует значительная деятельность по использованию систем in vitro для улучшения понимания механизмов действия токсичных веществ, а также использование человеческих клеток и тканей для определения специфических для человека токсических эффектов.
Большинство токсикологов считают, что методы тестирования токсичности in vitro могут быть более полезные, более эффективные по времени и рентабельности, чем токсикологические исследования на живых животных (которые называются методами in vivo или «в жизни»). Однако экстраполяция от in vitro к in vivo требует некоторого внимательного рассмотрения и является активной областью исследований.
Из-за нормативных ограничений и этических соображений поиск альтернатив тестированию на животных приобрел новый импульс. Во многих случаях тесты in vitro лучше, чем тесты на животных, поскольку их можно использовать для разработки более безопасных продуктов.
Агентство по охране окружающей среды США изучило 1065 химических и лекарственных веществ в рамках своей программы ToxCast. (часть CompTox Chemicals Dashboard ) с использованием моделирования диоксида кремния и анализа плюрипотентных стволовых клеток человека для прогнозирования in vivo развития интоксиканты, основанные на изменениях клеточного метаболизма после химического воздействия. Основные результаты анализа этого набора данных ToxCast_STM, опубликованного в 2020 году, включают: (1) 19% из 1065 химических веществ дали прогноз токсичности для развития, (2) эффективность анализа достигла точности 79% –82% с высокой специфичностью. (>84%), но умеренная чувствительность (< 67%) when compared with in vivo animal models of human prenatal developmental toxicity, (3) sensitivity improved as more stringent weights of evidence requirements were applied to the animal studies, and (4) statistical analysis of the most potent chemical hits on specific biochemical targets in ToxCast revealed positive and negative associations with the STM response, providing insights into the mechanistic underpinnings of the targeted endpoint and its biological domain.
96-луночный микротитровальный планшет, используемый для ELISA. Существует множество методов анализа для анализа исследуемых веществ на цитотоксичность и другие клеточные ответы.
Анализ МТТ часто используется для определения жизнеспособности клеток и был одобрен для использования международными организациями. Анализ МТТ включает два этапа: введение в анализ химических веществ и затем этап солюбилизации.
Колориметрический Анализ MTS (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -5- (3-карбоксиметоксифенил) -2- (4-сульфофенил) -2Hтетразолий) in vitro - это обновленная версия проверенного метода МТТ, анализ MTS имеет преимущество возраст растворимости. Следовательно, стадия солюбилизации не требуется.
АТФ имеет главное преимущество - быстрое получение результатов (в течение 15 минут) и требует только меньшего количества клеток образца. Анализ выполняет лизис клеток, и следующая химическая реакция между анализом и содержанием АТФ в клетках вызывает люминесценцию. Затем количество люминесценции измеряется фотометром и может быть переведено в число живых клеток, поскольку
Другой конечной точкой жизнеспособности клеток может быть поглощение нейтрального красного (NR). Нейтральный красный, слабый катионный краситель, проникает через клеточные мембраны недиффузией и накапливается межклеточно в лизосомах. Жизнеспособные клетки поглощают краситель NR, поврежденные или мертвые клетки - нет.
Наборы ELISA можно использовать для изучения повышающей и понижающей регуляции провоспалительных медиаторов, таких как цитокины (IL-1, TNF alpha, PGE2)....
Измерение этих типов клеточных ответов может быть окном во взаимодействие исследуемого препарата с тестовыми моделями (однослойные культуры клеток, трехмерные модели тканей, тканевые эксплантаты).
Вообще говоря, существует два различных типа исследований in vitro в зависимости от системы типов, разработанной для проведения эксперимента. Обычно используются два типа систем: а) система планшетов со статическими лунками и б) мультикомпартментные перфузионные системы.
Системы планшетов со статическими лунками или слоев представляют собой наиболее традиционную и простую форму анализов, широко используемых для исследований in vitro. Эти анализы весьма полезны, поскольку они довольно просты и обеспечивают очень доступную среду тестирования для мониторинга химических веществ в культуральной среде, а также в клетке. Однако недостатком использования этих простых анализов на статических планшетах с лунками является то, что они не могут отражать клеточные взаимодействия и физиологические условия потока жидкости, происходящие внутри тела.
В настоящее время разрабатываются новые испытательные платформы для решения проблем, связанных с клеточными взаимодействиями. Эти новые платформы намного сложнее и основаны на многокомпонентных перфузионных системах. Основная цель этих систем - более надежно воспроизводить механизмы in vivo, обеспечивая среду для культивирования клеток, близкую к ситуации in vivo. Каждый отсек в системе представляет собой определенный орган живого организма, и, следовательно, каждый отсек имеет определенные характеристики и критерии. Каждый отсек в этих системах соединен трубками и насосами, через которые течет жидкость, имитируя кровоток в ситуации in vivo. Недостатком использования этих перфузионных систем является то, что побочные эффекты (влияние как биологических, так и небиологических компонентов системы на судьбу исследуемого химического вещества) больше по сравнению со статическими системами. Чтобы уменьшить влияние небиологических компонентов системы, все отсеки сделаны из стекла, а соединительные трубки - из тефлона. Был предложен ряд кинетических моделей для устранения этих неспецифических связываний, имеющих место в этих системах in vitro.
Для устранения биологических трудностей, возникающих при использовании различных условий культивирования in vitro, традиционные модели используемые во флаконах или планшетах с микропланшетами, необходимо модифицировать. Параллельно с развитием микротехнологий и тканевой инженерии эти проблемы решаются с помощью новых подходящих инструментов, называемых «микрожидкостные биочипы».
