Иммуноцитохимия

редактировать
Иммуноцитохимия маркирует отдельные белки внутри клеток, например TH (зеленый) в аксонах симпатических автономных нейронов.

Иммуноцитохимия (ICC ) - это распространенный лабораторный метод, который используется для анатомической визуализации локализации определенного белка или антигена в клетках с помощью специфического первичного антитела, которое с ним связывается. Первичное антитело позволяет визуализировать белок под флуоресцентным микроскопом , когда он связан с вторичным антителом, которое имеет конъюгированный флуорофор. ICC позволяет исследователям оценить, экспрессируют ли клетки определенного образца рассматриваемый антиген. В случаях, когда обнаруживается иммунопозитивный сигнал, ICC также позволяет исследователям определить, какие субклеточные компартменты экспрессируют антиген.

Содержание

  • 1 Иммуноцитохимия против иммуногистохимии
  • 2 Методы
  • 3 Ссылки
  • 4 Внешние ссылки

Иммуноцитохимия против иммуногистохимии

Иммуноцитохимия отличается от иммуногистохимии тем, что первый выполняется на образцах интактных клеток, у которых была удалена большая часть, если не все, окружающий их внеклеточный матрикс. Сюда входят отдельные клетки, которые были изолированы из блока твердой ткани, клетки, выращенные в культуре, клетки, депонированные из суспензии, или клетки, взятые из мазок. Напротив, иммуногистохимические образцы представляют собой срезы биологической ткани, где каждая клетка окружена тканевой архитектурой, а другие клетки обычно находятся в интактной ткани. Иммуноцитохимия - это метод, используемый для оценки присутствия определенного белка или антигена в клетках (культивируемых клетках, клеточных суспензиях) с помощью специфического антитела, которое связывается с ним, что позволяет визуализировать и исследовать под микроскопом. Это ценный инструмент для определения клеточного содержимого отдельных клеток. Образцы, которые можно проанализировать, включают мазки крови, аспираты, мазки, культивированные клетки и клеточные суспензии.

Есть много способов подготовить образцы клеток для иммуноцитохимического анализа. У каждого метода есть свои сильные стороны и уникальные характеристики, поэтому можно выбрать правильный метод для желаемой выборки и результата.

Клетки, подлежащие окрашиванию, можно прикрепить к твердой подложке, чтобы облегчить использование в последующих процедурах. Этого можно достичь несколькими способами: прилипшие клетки можно выращивать на предметных стеклах микроскопа, покровных стеклах или на оптически подходящей пластиковой подложке. Суспензионные клетки можно центрифугировать на предметных стеклах (цитоспин ), связать с твердой подложкой с помощью химических линкеров или, в некоторых случаях, обращаться с суспензией.

Концентрированные клеточные суспензии, существующие в среде с низкой вязкостью, являются хорошими кандидатами для приготовления мазков. Разбавленные клеточные суспензии, существующие в разбавленной среде, лучше всего подходят для получения цитоспинов путем цитоцентрифугирования. Суспензии клеток, существующие в среде с высокой вязкостью, лучше всего подходят для тестирования в качестве препаратов мазков. Постоянным среди этих препаратов является то, что вся клетка присутствует на поверхности предметного стекла. Для того, чтобы произошла какая-либо межклеточная реакция, иммуноглобулин должен сначала пройти через клеточную мембрану, которая не повреждена в этих препаратах. Реакции, происходящие в ядре, могут быть более сложными, а внеклеточные жидкости могут создавать уникальные препятствия для выполнения иммуноцитохимии. В этой ситуации становится необходимым повышение проницаемости клеток с помощью детергента (Triton X-100 или Tween-20) или выбора органических фиксаторов (ацетон, метанол или этанол).

Антитела являются важным инструментом для демонстрации как присутствия, так и субклеточной локализации антигена. Окрашивание клеток - это очень универсальный метод, и, если антиген сильно локализован, он может обнаружить всего лишь тысячу молекул антигена в клетке. В некоторых случаях окрашивание клеток также может использоваться для определения приблизительной концентрации антигена, особенно с помощью анализатора изображений.

Методы

Существует множество методов иммунологического обнаружения тканей, включая методы, непосредственно связанные с первичными антителами или антисыворотками. Прямой метод включает использование детектируемой метки (например, флуоресцентной молекулы, частиц золота и т. Д.) Непосредственно к антителу, которому затем позволяют связываться с антигеном (например, белком) в клетке.

Кроме того, существует множество косвенных методов . В одном из таких методов антиген связывается с первичным антителом, которое затем амплифицируется с использованием вторичного антитела, которое связывается с первичным антителом. Затем наносится третичный реагент, содержащий ферментативный фрагмент, который связывается со вторичным антителом. Когда применяется четвертичный реагент или субстрат, ферментативный конец третичного реагента превращает субстрат в продукт реакции пигмента, который дает цвет (возможны многие цвета; коричневый, черный, красный и т. Д.) В том же самом место, где исходное первичное антитело распознало интересующий антиген.

Некоторыми примерами используемых субстратов (также известных как хромогены) являются AEC (3-амино-9-этилкарбазол) или DAB (3,3'-диаминобензидин ). Использование одного из этих реагентов после воздействия необходимого фермента (например, пероксидазы хрена, конъюгированной с реагентом антител) дает положительный продукт иммунореакции. Иммуноцитохимическая визуализация конкретных представляющих интерес антигенов может использоваться, когда менее специфические пятна, такие как HE (гематоксилин и эозин), не могут использоваться для постановки диагноза или для предоставления дополнительной прогностической информации относительно лечения (например, при некоторых раковых заболеваниях).

В качестве альтернативы вторичное антитело может быть ковалентно связано с флуорофором (наиболее распространенными являются FITC и родамин ), который обнаруживается при флуоресценции. или конфокальный микроскоп. Местоположение флуоресценции будет варьироваться в зависимости от молекулы-мишени, внешнее для мембранных белков и внутреннее для цитоплазматических белков. Таким образом, иммунофлуоресценция является мощным методом в сочетании с конфокальной микроскопией для изучения локализации белков и динамических процессов (экзоцитоз, эндоцитоз, так далее.).

Ссылки

Внешние ссылки

Последняя правка сделана 2021-05-23 12:14:07
Содержание доступно по лицензии CC BY-SA 3.0 (если не указано иное).
Обратная связь: support@alphapedia.ru
Соглашение
О проекте