Пятно Хёхста

редактировать
Химическая структура красителей Hoechst.

Пятна Hoechst являются частью семейства синих флуоресцентных красителей, используемых для окрашивают ДНК. Эти бис-бензимиды были первоначально разработаны Hoechst AG, которая пронумеровала все свои соединения так, что краситель Hoechst 33342 является 33,342-м соединением, произведенным компанией. Существует три родственных красителя Hoechst: Hoechst 33258, Hoechst 33342 и Hoechst 34580. Красители Hoechst 33258 и Hoechst 33342 являются наиболее часто используемыми и имеют схожие спектры возбуждения - излучения.

Содержание

  • 1 Молекулярные характеристики
  • 2 Области применения
  • 3 Токсичность и безопасность
  • 4 См. Также
  • 5 Ссылки
  • 6 Внешние ссылки

Молекулярные характеристики

Спектры излучения-возбуждения Hoechst красители.

Оба красителя возбуждаются ультрафиолетовым светом с длиной волны около 350 нм, и оба излучают сине-голубой флуоресцентный свет вокруг спектра излучения . максимум при 461 нм. Несвязанный краситель имеет максимальное излучение флуоресценции в диапазоне 510–540 нм. Пятна Hoechst можно возбудить с помощью ксенон- или ртутно-дуговой лампы или ультрафиолетового лазера. Существует значительный стоксов сдвиг между спектрами возбуждения и испускания, который делает красители Hoechst полезными в экспериментах, в которых используются несколько флуорофоров. Интенсивность флуоресценции красителей Hoechst также увеличивается с увеличением pH растворителя.

Красители Hoechst растворимы в воде и в органических растворителях, таких как диметилформамид или диметилсульфоксид. Концентрация может достигать 10 мг / мл. Водные растворы стабильны при 2–6 ° C не менее шести месяцев в защищенном от света месте. Для длительного хранения растворы вместо этого замораживают при температуре –20 ° C или ниже.

Hoechst 33258 (пурпурный) связан с малой бороздкой ДНК (зеленый и синий). Из PDB : 264D ​.

Красители связываются с малой бороздкой двухцепочечной ДНК с предпочтением последовательностей, богатых аденином и тимин. Хотя красители могут связываться со всеми нуклеиновыми кислотами, богатые АТ двухцепочечные цепи ДНК значительно усиливают флуоресценцию. Красители Hoechst являются проницаемыми для клеток и могут связываться с ДНК в живых или фиксированных клетках. Таким образом, эти пятна часто называют суправитальными, что означает, что живые клетки выживают после обработки этими соединениями. Клетки, которые экспрессируют специфический АТФ-связывающий кассетный транспортер белки, также могут активно переносить эти пятна из своей цитоплазмы.

Приложения

Передающее изображение HeLa клеток, с наложением окрашивания Hoechst 33258 (синий). Самая левая клетка находится на стадии прометафазы митоза ; его хромосомы ярко флуоресцируют, потому что они содержат сильно уплотненную ДНК. Флуоресцентное изображение культивированных нейтрофилов, выделенных из венозной крови человека с болезнью Альцгеймера. Образец обрабатывали красителем Hoechst 33342, который используется для окрашивания ДНК. На снимке показано высвобождение ДНК нейтрофилом в виде туманной области в центре поля зрения, что указывает на спонтанную активацию образования внеклеточных ловушек нейтрофилов у пациентов с БА, что обычно не наблюдается у здоровых партнеров.

Концентрация 0,1–12 мкг / мл обычно используют для окрашивания ДНК в клетках бактерий или эукариот. Клетки окрашивают в течение 1-30 мин при комнатной температуре или 37 ° C, а затем промывают для удаления несвязавшегося красителя. Зеленая флуоресценция несвязанного красителя Hoechst может наблюдаться на образцах, окрашенных слишком большим количеством красителя или частично промытых. Красители Hoechst часто используются как заменители другого красителя нуклеиновой кислоты, называемого DAPI.

. Ключевые различия между красителями Hoechst и DAPI заключаются в следующем:

  • красители Hoechst менее токсичны, чем DAPI, что обеспечивает более высокую жизнеспособность окрашенных клеток
  • Дополнительная этильная группа красителей Hoechst делает их более проницаемыми для клеток.
  • Существуют красители, окрашивающие ядра, которые обеспечивают жизнеспособность клеток после окрашивания.

Hoechst 33342 и 33258 гасят с помощью бромдезоксиуридина (BrdU), который обычно используется для обнаружения делящихся клеток. Hoechst 33342 демонстрирует в 10 раз большую проницаемость для клеток, чем H 33258. Клетки могут интегрировать BrdU во вновь синтезированную ДНК в качестве заменителя тимидина. Когда BrdU интегрируется в ДНК, предполагается, что бром деформирует малую бороздку, так что красители Hoechst не могут достичь своего оптимального сайта связывания. Связывание красителей Hoechst даже сильнее с BrdU-замещенной ДНК; однако флуоресценции не происходит. Красители Hoechst можно использовать с BrdU для мониторинга клеточного цикла прогрессирования.

Красители Hoechst обычно используются для окрашивания геномной ДНК в следующих областях:

Отток Хёхста также используется для изучения гемопоэтических и эмбриональных стволовых клеток. Поскольку эти клетки способны эффективно выводить краситель, они могут быть обнаружены с помощью проточной цитометрии в так называемой боковой популяции. Это достигается путем пропускания флуоресценции, испускаемой возбужденным хехстом, через красный и синий фильтры и построения графиков красного и синего цветов по отношению друг к другу.

Токсичность и безопасность

Потому что красители Hoechst связываются с ДНК, они мешают репликации ДНК во время деления клетки. Следовательно, они потенциально мутагенные и канцерогенные, поэтому следует соблюдать осторожность при обращении с ними и их утилизации. Окраска Hoechst используется для сортировки сперматозоидов у домашнего скота и людей. Его безопасность обсуждалась.

См. Также

Ссылки

Внешние ссылки

На Викискладе есть материалы, относящиеся к окрашиванию Hoechst.
Последняя правка сделана 2021-05-23 03:45:13
Содержание доступно по лицензии CC BY-SA 3.0 (если не указано иное).
Обратная связь: support@alphapedia.ru
Соглашение
О проекте