Войти
Анализ гемагглютинации различных образцов гриппа, разведенных слева направо справа. анализ гемагглютинации или анализ гемагглютинации (HA) и анализ ингибирования гемагглютинации (HIили HAI ) были разработаны в 1941–1941 гг. 42 американского вирусолога Джорджа Херста в качестве методов для количественной оценки относительной концентрации вирусов, бактерий или антител.
HA и HI применяют процесс гемагглютинации, при котором рецепторы сиаловой кислоты на поверхности красных кровяных телец (эритроцитов) связываются с гемагглютинином g. ликопротеин, обнаруженный на поверхности вируса гриппа (и нескольких других вирусов), создает сеть или решетчатую структуру из взаимосвязанных эритроцитов и вирусных частиц. Агглютинированная решетка поддерживает распределение эритроцитов во взвешенном состоянии, которое обычно рассматривается как диффузный красноватый раствор. Формирование решетки зависит от концентраций вируса и эритроцитов, и когда относительная концентрация вируса слишком низкая, эритроциты не ограничиваются решеткой и оседают на дно лунки. Гемагглютинация наблюдается в присутствии стафилококков, вибрионов и других видов бактерий, аналогично механизму, который используют вирусы для агглютинации эритроцитов. RBC, используемые в анализах HA и HI, обычно получают от цыплят, индеек, лошадей, морских свинок или людей в зависимости от селективности целевого вируса или бактерии и связанных с ними поверхностных рецепторов на RBC.
Общая процедура для HA следующая: Серийное разведение вируса готовят по рядам в 96-луночном микротитровальном планшете U- или V-образной формы. Наиболее концентрированный образец в первой лунке часто разбавляется до 1/5 от исходного раствора, а последующие лунки обычно представляют собой двукратные разведения (1/10, 1/20, 1/40 и т. Д.). Последняя лунка служит отрицательным контролем без вируса. В каждом ряду планшета обычно содержится другой вирус и одинаковая схема разведения. После серийных разведений в каждую лунку добавляют стандартизированную концентрацию эритроцитов и осторожно перемешивают. Планшет инкубируют 30 минут при комнатной температуре. После инкубационного периода анализ можно проанализировать, чтобы различить агглютинированные и неагглютинированные лунки. Изображения в ряду обычно переходят от агглютинированных лунок с высокой концентрацией вируса и диффузного красноватого оттенка к серии лунок с низкими концентрациями вируса, содержащих темно-красный осадок или кнопку в центре лунки. Лунки с низкой концентрацией кажутся почти идентичными лункам с отрицательным контролем без вирусов. Появление кнопки происходит из-за того, что эритроциты не удерживаются в агглютинированной решетчатой структуре и оседают в нижней точке лунки с U- или V-образным дном. Переход от агглютинированных лунок к неагглютинированным происходит отчетливо, в пределах 1-2 лунок.
Относительная концентрация или титр образца вируса основывается на лунке с последним проявлением агглютинации, непосредственно перед наблюдением осадка. По отношению к исходной концентрации исходного вируса концентрация вируса в этой лунке будет представлять собой некоторое разбавление исходного материала, например, в 1/40 раза. Значение титра этого образца является обратным разведению, то есть 40. В некоторых случаях вирус изначально разбавлен настолько, что агглютинированные лунки никогда не наблюдаются. В этом случае титру этих образцов обычно присваивается 5, что указывает на максимально возможную концентрацию, но точность этого значения явно низкая. В качестве альтернативы, если относительная концентрация вируса чрезвычайно высока и лунки никогда не переходят в вид кнопки. Затем обычно назначается значение титра наивысшего разведения, например 5120.
HI тесно связан с анализом HA, но включает антивирусные антитела в качестве «ингибиторов», препятствующих взаимодействию вируса с эритроцитами.. Цель состоит в том, чтобы охарактеризовать концентрацию антител в антисыворотке или других образцах, содержащих антитела. HI-анализ обычно выполняется путем создания серии разведений антисыворотки по рядам 96-луночного микротитровального планшета. Каждая строка обычно представляет собой отдельный образец. В каждую лунку добавляют стандартизованное количество вируса или бактерий, и смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут. Последняя лунка в каждом ряду будет отрицательным контролем без добавления вируса. Во время инкубации антитела связываются с вирусными частицами, и если концентрация и аффинность связывания антител достаточно высоки, вирусные частицы эффективно блокируются и не вызывают гемагглютинацию. Затем в каждую лунку добавляют стандартизованное количество эритроцитов и инкубируют при комнатной температуре в течение дополнительных 30 минут. Полученные в результате изображения планшета HI обычно переходят от неагглютинированных лунок «пуговицы» с высокой концентрацией антител к агглютинированным красным диффузным лункам с низкой концентрацией антител. Значение титра HI является обратной величиной последнего разведения сыворотки, которое полностью ингибировало гемагглютинацию.
Предыдущие описания процессов HA и HI являются обобщенными, и конкретные детали могут варьироваться в зависимости от оператора и лаборатории. Например, описаны серийные разведения по рядам, но некоторые лаборатории используют альтернативную ориентацию и вместо этого выполняют разведения по столбцам. Точно так же начальное разведение, фактор серийного разведения, время инкубации и выбор планшета с U- или V-донным дном могут зависеть от конкретной лаборатории.
HA и HI имеют преимущества, заключающиеся в простоте анализа, использовании относительно недорогих и доступных инструментов и расходных материалов и получении результатов в течение нескольких часов. Анализы также хорошо зарекомендовали себя во многих лабораториях по всему миру, что позволяет в какой-то мере обеспечить надежность, сравнение и стандартизацию.
Оптимальные и надежные результаты требуют контроля нескольких переменных, таких как время инкубации, концентрация красных кровяных телец и тип красных кровяных телец. Неспецифические факторы в образце могут привести к помехам и неправильным значениям титра. Например, молекулы в образце, отличные от вирус-специфичных антител, могут ингибировать агглютинацию между вирусом и эритроцитами, а также потенциально блокировать связывание антител с вирусом. Ферменты, разрушающие рецепторы (RDE), обычно используются для обработки образцов перед анализом, чтобы предотвратить неспецифическое ингибирование. Анализ результатов HA или HI полагается на квалифицированного специалиста, который прочтет планшет и определит значения титра. Метод ручной интерпретации дает больше возможностей для расхождений в анализе, потому что результаты могут быть субъективными, а согласие между людьми-читателями противоречиво. Кроме того, отсутствует цифровая запись результатов определения на планшете или титра, поэтому первоначальная интерпретация утомительна и обычно выполняется в повторностях. Диапазон возможных переменных и различий между экспертами-читателями может затруднить сравнение результатов между лабораториями.
