Войти
Генная инженерия может быть выполнена с использованием нескольких методов. Перед созданием генетически модифицированного организма (ГМО) необходимо выполнить ряд шагов. Генные инженеры должны сначала выбрать, какой ген они хотят вставить, изменить или удалить. Затем необходимо выделить ген и включить его вместе с другими генетическими элементами в подходящий вектор . Затем этот вектор используется для вставки гена в геном хозяина, создавая трансгенный или измененный организм. Возможность генетической инженерии организмов основана на многолетних исследованиях и открытиях того, как функционируют гены и как мы можем ими манипулировать. Важные достижения включают открытие рестрикционных ферментов и ДНК-лигаз и разработку полимеразной цепной реакции и секвенирования.
. Это позволило получить интересующий ген быть изолированным и затем включенным в вектор. Часто добавляли область промотора и терминатора, а также ген селектируемого маркера. На этом этапе ген можно дополнительно модифицировать, чтобы заставить его экспрессировать более эффективно. Затем этот вектор вставляют в геном организма-хозяина. У животных ген обычно вставляют в эмбриональные стволовые клетки, тогда как у растений он может быть вставлен в любую ткань, которую можно культивировать в полностью развитом растении. Обычные методы включают микроинъекцию, вирус-опосредованную, опосредованную Agrobacterium или биолистику. На полученном организме проводятся дальнейшие тесты, чтобы гарантировать стабильную интеграцию, наследование и экспрессию. Потомки первого поколения гетерозиготны, что требует их инбредности для создания гомозиготного паттерна, необходимого для стабильного наследования. Гомозиготность должна быть подтверждена на образцах второго поколения.
Традиционные методы случайным образом вставляли гены в геном хозяина. Достижения позволили вставлять гены в определенные места в геноме, что снижает нежелательные побочные эффекты случайной вставки. Ранние системы нацеливания основывались на мегануклеазах и нуклеазах цинковых пальцев. С 2009 года были разработаны более точные и простые в реализации системы. эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции (TALENs) и система Cas9-guideRNA (адаптированная из CRISPR ), являются двумя наиболее часто используемыми. Они потенциально могут быть полезны в генной терапии и других процедурах, требующих точного или высокопроизводительного нацеливания.
Множество различных открытий и достижений привели к развитию генной инженерии. Управляемые человеком генетические манипуляции начались с одомашнивания растений и животных посредством искусственного отбора примерно в 12000 году до нашей эры. Были разработаны различные методы, помогающие в разведении и селекции. Гибридизация была одним из способов быстрого изменения генетической структуры организма. Гибридизация сельскохозяйственных культур, скорее всего, впервые произошла, когда люди начали выращивать генетически различных особей родственных видов в непосредственной близости. Некоторые растения можно было размножать с помощью вегетативного клонирования.
Генетическое наследование было впервые обнаружено Грегором Менделем в 1865 году после экспериментов по скрещиванию гороха. В 1928 году Фредерик Гриффит доказал существование «трансформирующего принципа», вовлеченного в наследование, которое в 1944 году было идентифицировано как ДНК Освальдом Эйвери, Колином Маклаудом и Маклином Маккарти. Фредерик Сэнгер разработал метод секвенирования ДНК в 1977 году, значительно увеличив генетическую информацию, доступную исследователям.
После открытия существования и свойств ДНК пришлось разработать инструменты, позволяющие манипулировать ею. В 1970 году лаборатория Hamilton Smiths открыла рестрикционные ферменты, позволяющие ученым выделять гены из генома организма. ДНК-лигазы, которые соединяют разорванные ДНК, были обнаружены ранее в 1967. Благодаря объединению двух ферментов стало возможным «вырезать и вставить» последовательности ДНК, чтобы создать рекомбинантную ДНК. Плазмиды, открытые в 1952 году, стали важными инструментами для передачи информации между клетками и репликации последовательностей ДНК. Полимеразная цепная реакция (ПЦР), разработанная Кэри Маллис в 1983 году, позволила амплифицировать (реплицировать) небольшие участки ДНК и способствовала идентификации и выделению генетического материала.
Помимо манипулирования ДНК, необходимо было разработать методы ее внедрения в геном организма. Эксперимент Гриффита уже показал, что некоторые бактерии обладают способностью естественным образом поглощать и экспрессировать чужеродную ДНК. Искусственная компетентность была вызвана у Escherichia coli в 1970 году обработкой их раствором хлорида кальция (CaCl 2). Трансформация с использованием электропорации была разработана в конце 1980-х годов, увеличивая эффективность и диапазон бактерий. В 1907 году была обнаружена бактерия, вызывающая опухоли растений, Agrobacterium tumefaciens. В начале 1970-х годов было обнаружено, что эти бактерии встраивали свою ДНК в растения, используя плазмиду Ti. Удалив из плазмиды гены, вызвавшие опухоль, и добавив новые гены, исследователи смогли заразить растения A. tumefaciens и позволить бактериям вставить выбранную ДНК в геномы растений.
Первым шагом является идентификация целевого гена или генов для вставки в организм-хозяин. Это обусловлено целью для результирующего организма. В некоторых случаях поражается только один или два гена. Для более сложных задач могут быть задействованы целые биосинтетические пути с участием множества генов. Найденные гены и другая генетическая информация от широкого круга организмов может быть вставлена в бактерии для хранения и модификации, создавая генетически модифицированные бактерии в процессе. Бактерии дешевы, их легко выращивать, клонально, они быстро размножаются, относительно легко трансформируются и могут храниться при -80 ° C почти неограниченное время. После выделения гена его можно хранить внутри бактерий, обеспечивая неограниченный запас для исследований.
Генетический скрининг может быть проведен для определения потенциальных генов с последующими другими тестами для определения лучших кандидатов. Простой экран включает случайную мутацию ДНК химическими веществами или излучением, а затем выбор тех, которые отображают желаемый признак. Для организмов, в которых мутация нецелесообразна, ученые вместо этого ищут людей среди населения, которые проявляют характеристику через естественные мутации. Процессы, которые рассматривают фенотип и затем пытаются идентифицировать ответственный ген, называются прямой генетикой. Затем ген необходимо картировать путем сравнения наследования фенотипа с известными генетическими маркерами. Близкие гены, скорее всего, наследуются вместе.
Другой вариант - обратная генетика. Этот подход включает нацеливание на конкретный ген с мутацией, а затем наблюдение за тем, какой фенотип развивается. Мутация может быть разработана так, чтобы инактивировать ген или позволить ему стать активным только при определенных условиях. Условные мутации полезны для идентификации генов, которые обычно являются летальными, если не работают. Поскольку гены со схожими функциями имеют сходные последовательности (гомологичные ), можно предсказать вероятную функцию гена, сравнив его последовательность с последовательностью хорошо изученных генов из модельных организмов. Разработка микрочипов, транскриптомов и секвенирования генома значительно упростила поиск нужных генов.
Бактерии Bacillus thuringiensis был впервые обнаружен в 1901 г. как возбудитель смерти тутовых шелкопрядов. Благодаря этим инсектицидным свойствам бактерии были использованы в качестве биологического инсектицида, коммерчески разработанного в 1938 году. cry белки были обнаружены для обеспечения инсектицидной активности в 1956 году, а к 1980-м годам Ученые успешно клонировали ген, кодирующий этот белок, и экспрессировали его в растениях. Ген, обеспечивающий устойчивость к гербициду глифосату, был обнаружен после семи лет поиска бактерий, обитающих в выпускной трубе производственного предприятия Monsanto RoundUp. У животных большинство используемых генов - это гены гормона роста.
Все процессы генной инженерии включают модификацию ДНК. Традиционно ДНК выделяли из клеток организмов. Позже гены стали клонировать из сегмента ДНК после создания библиотеки ДНК или искусственно синтезировать. После выделения к гену добавляются дополнительные генетические элементы, позволяющие ему экспрессироваться в организме-хозяине и способствовать отбору.
Сначала клетку нужно аккуратно открыть, обнажая ДНК, не нанося ей слишком большого повреждения. Используемые методы различаются в зависимости от типа ячейки. После открытия ДНК необходимо отделить от других клеточных компонентов. Разорванная клетка содержит белки и другие клеточные остатки. Путем смешивания с фенолом и / или хлороформом с последующим центрифугированием нуклеиновые кислоты могут быть отделены от этого дебриса на верхнюю водную фазу. Эта водная фаза может быть удалена и при необходимости очищена путем повторения стадий фенол-хлороформ. Затем нуклеиновые кислоты могут быть осаждены из водного раствора с использованием этанола или изопропанола. Любую РНК можно удалить, добавив рибонуклеазу, которая расщепит ее. Сейчас многие компании продают наборы, упрощающие этот процесс.
Интересующий ген необходимо отделить от выделенной ДНК. Если последовательность неизвестна, тогда распространенным методом является разбиение ДНК методом случайного расщепления. Обычно это достигается с помощью рестрикционных ферментов (ферментов, разрезающих ДНК). Частичный рестрикционный гидролизат вырезает только некоторые из рестрикционных сайтов, в результате чего сегменты фрагментов ДНК перекрываются. Фрагменты ДНК помещают в отдельные плазмидные векторы и выращивают внутри бактерий. Попадая в бактерии, плазмида копируется по мере деления бактерий. Чтобы определить, присутствует ли полезный ген в конкретном фрагменте, библиотека ДНК проверяется на желаемый фенотип. Если фенотип обнаружен, возможно, бактерия содержит целевой ген.
Если ген не имеет поддающегося обнаружению фенотипа или библиотека ДНК не содержит правильный ген, необходимо использовать другие методы для его выделения. Если положение гена можно определить с помощью молекулярных маркеров, то ходьба по хромосоме является одним из способов выделения правильного фрагмента ДНК. Если ген проявляет близкую гомологию к известному гену у другого вида, то его можно выделить путем поиска генов в библиотеке, которые близко соответствуют известному гену.
Для известных последовательностей ДНК, Можно использовать рестрикционные ферменты, которые разрезают ДНК по обе стороны от гена. Гель-электрофорез затем сортирует фрагменты по длине. Некоторые гели могут разделять последовательности, которые отличаются одной парой оснований . ДНК можно визуализировать, окрашивая ее бромидом этидия и фотографируя в УФ-свете. Маркер с фрагментами известной длины может быть размещен рядом с ДНК для оценки размера каждой полосы. Полоса ДНК правильного размера должна содержать ген, который можно вырезать из геля. Другой метод выделения генов с известными последовательностями включает полимеразную цепную реакцию (ПЦР). ПЦР - это мощный инструмент, с помощью которого можно амплифицировать заданную последовательность, которую затем можно выделить с помощью гель-электрофореза. Его эффективность снижается с более крупными генами и может вносить ошибки в последовательность.
Можно искусственно синтезировать гены. Некоторые синтетические последовательности доступны коммерчески, в них отсутствуют многие из этих ранних этапов.
Вставляемый ген должен быть объединен с другими генетическими элементами, чтобы он работал должным образом. На этом этапе ген можно модифицировать для лучшей экспрессии или эффективности. Помимо гена, который должен быть вставлен, большинство конструкций содержат область промотора и терминатора, а также ген селектируемого маркера. Промоторная область инициирует транскрипцию гена и может использоваться для контроля местоположения и уровня экспрессии гена, в то время как терминаторная область завершает транскрипцию. Селективный маркер, который в большинстве случаев придает устойчивость к антибиотикам организму, в котором он экспрессируется, используется для определения того, какие клетки трансформируются новым геном. Конструкции создаются с использованием методов рекомбинантной ДНК, таких как рестрикционные переваривания, лигирования и молекулярное клонирование.
После того, как ген сконструирован, он должен быть стабильно интегрирован в геном целевых организмов или существовать как внехромосомная ДНК. Существует ряд доступных методов для встраивания гена в геном хозяина, и они различаются в зависимости от типа организма-мишени. У многоклеточных эукариот, если трансген включен в клетки зародышевой линии хозяина, полученная хозяйская клетка может передать трансген своему потомству. Если трансген включен в соматические клетки, трансген не может быть унаследован.
Бактериальная трансформация включает перемещение гена от одной бактерии к другой. Он интегрирован в плазмиду реципиента. и затем может быть экспрессирован новым хозяином. Трансформация - это прямое изменение генетических компонентов клетки путем прохождения генетического материала через клеточную мембрану. Около 1% бактерий естественным образом способны поглощать чужеродную ДНК, но эта способность может быть индуцирована у других бактерий. Воздействие на бактерии тепловым шоком или электропорацией может сделать клеточную мембрану проницаемой для ДНК, которая затем может быть включена в геном или существовать в виде внехромосомной ДНК. Обычно клетки инкубируют в растворе, содержащем двухвалентных катионов (часто хлорида кальция ) в холодных условиях, прежде чем подвергнуть воздействию теплового импульса (теплового шока). Хлорид кальция частично разрушает клеточную мембрану, что позволяет рекомбинантной ДНК проникать в клетку-хозяин. Предполагается, что воздействие на клетки двухвалентных катионов в холодных условиях может изменить или ослабить структуру поверхности клетки, сделав ее более проницаемой для ДНК. Считается, что тепловой импульс создает тепловой дисбаланс на клеточной мембране, который заставляет ДНК проникать в клетки либо через клеточные поры, либо через поврежденную клеточную стенку. Электропорация - еще один метод повышения компетентности. В этом методе клетки кратковременно подвергают электрошоку электрическим полем 10-20 кВ / см, которое, как считается, создает отверстия в клеточной мембране, через которые может проникать плазмидная ДНК. После поражения электрическим током отверстия быстро закрываются механизмами восстановления мембраны клетки. Полученная ДНК может либо интегрироваться с геномом бактерий, либо, чаще, существовать как внехромосомная ДНК.
Генная пушка использует биолистику для вставки ДНК в ткань растения 
A. tumefaciens прикрепляется к клетке моркови В растения ДНК часто встраивают с использованием Agrobacterium-опосредованной рекомбинации, используя преимущества последовательности Agrobacteriums T-ДНК, которая позволяет естественным внедрение генетического материала в клетки растений. Ткани растений разрезают на мелкие кусочки и замачивают в жидкости, содержащей суспендированные агробактерии. Бактерии прикрепляются ко многим растительным клеткам, обнаженным порезами. Бактерии используют конъюгацию для переноса сегмента ДНК, называемого Т-ДНК, из своей плазмиды в растение. Перенесенная ДНК направляется в ядро растительной клетки и интегрируется в геномную ДНК растения-хозяина. Т-ДНК плазмиды интегрируется полуслучайно в геном клетки-хозяина.
Автором модифицируя плазмиду для экспрессии интересующего гена, исследователи могут стабильно вставлять выбранный ген в геном растения. Единственными существенными частями Т-ДНК являются два ее небольших (25 пар оснований) пограничных повтора, по крайней мере, один из которых необходим для трансформации растений. Гены, которые должны быть введены в растение, клонируют в вектор трансформации растений, который содержит область Т-ДНК плазмиды . Альтернативный метод - это агроинфильтрация.
Другой метод, используемый для трансформации растительных клеток, - это биолистик, где частицы золота или вольфрама покрываются ДНК, а затем вводятся в молодые клетки растений или зародыши растений. Некоторый генетический материал попадает в клетки и трансформирует их. Этот метод может быть использован на растениях, которые не восприимчивы к инфекции Agrobacterium, а также позволяет трансформировать пластиды растений. Клетки растений также можно трансформировать с помощью электропорации, которая использует электрический шок, чтобы сделать клеточную мембрану проницаемой для плазмидной ДНК. Из-за повреждения клеток и ДНК эффективность трансформации биолистики и электропорации ниже, чем агробактериальная трансформация.
Трансформация имеет другое значение по отношению к животных, что указывает на прогрессирование до ракового состояния, поэтому процесс, используемый для вставки чужеродной ДНК в клетки животных, обычно называется трансфекцией. Существует много способов прямого введения ДНК в клетки животных in vitro. Часто эти клетки представляют собой стволовые клетки, которые используются для генной терапии. В химических методах используются природные или синтетические соединения для образования частиц, которые способствуют переносу генов в клетки. Эти синтетические векторы обладают способностью связывать ДНК и приспосабливать большие генетические передачи. Один из простейших методов включает использование фосфата кальция для связывания ДНК с последующим воздействием на нее культивируемых клеток. Раствор вместе с ДНК инкапсулируется клетками. Липосомы и полимеры можно использовать в качестве векторов для доставки ДНК в культивируемые клетки животных. Положительно заряженные липосомы связываются с ДНК, а полимеры могут взаимодействовать с ДНК. Они образуют соответственно липоплексы и полиплексы, которые затем захватываются клетками. Другие методы включают использование электропорации и биолистики. В некоторых случаях трансфицированные клетки могут стабильно интегрировать внешнюю ДНК в свой собственный геном. Этот процесс известен как стабильная трансфекция.
. Для создания трансгенных животных ДНК необходимо вставить в жизнеспособные эмбрионы или яйца. Обычно это достигается с помощью микроинъекции, где ДНК вводится через ядерную оболочку клетки непосредственно в ядро . Собираются суперовулированные оплодотворенные яйца на стадии одноклеточных и культивируемых in vitro. Когда пронуклеусы головки сперматозоида и яйцеклетки видны через протоплазму, генетический материал вводится в один из них. Затем ооцит имплантируют в яйцевод животного псевдобеременного. Другой метод - это перенос генов, опосредованный эмбриональными стволовыми клетками. Ген трансфицируется в эмбриональные стволовые клетки, а затем они вставляются в мышиные бластоцисты, которые затем имплантируются приемным матерям. Полученное потомство является химерным, и дальнейшее спаривание может дать мышей, полностью трансгенных с интересующим геном.
Трансдукция - это процесс, посредством которого чужеродная ДНК вводится в клетку с помощью вируса или вирусного вектора. Генетически модифицированные вирусы могут использоваться в качестве вирусных векторов для переноса генов-мишеней в другой организм в генной терапии. Сначала вирулентные гены удаляются из вируса, а вместо них вставляются гены-мишени. Последовательности, которые позволяют вирусу вставлять гены в организм-хозяин, должны оставаться нетронутыми. Популярные вирусные векторы разработаны из ретровирусов или аденовирусов. Другие вирусы, используемые в качестве векторов, включают лентивирусы, вирусы оспы и вирусы герпеса. Тип используемого вируса будет зависеть от клеток-мишеней и от того, нужно ли изменять ДНК навсегда или временно.
Поскольку часто только одна клетка трансформируется генетическим материалом, организм должен быть регенерирован из этой единственной клетки. У растений это достигается за счет использования культуры ткани. У каждого вида растений разные требования для успешного восстановления. В случае успеха методика дает взрослое растение, которое содержит трансген в каждой клетке. У животных необходимо убедиться, что встроенная ДНК присутствует в эмбриональных стволовых клетках. Потомство можно проверить на наличие гена. Все потомки первого поколения являются гетерозиготными для встроенного гена и должны быть инбредными для получения гомозиготного образца. Бактерии состоят из одной клетки и размножаются клонально, поэтому в регенерации нет необходимости. Выбираемые маркеры используются для простой дифференциации трансформированных клеток от нетрансформированных.
Клетки, которые были успешно трансформированы ДНК, содержат маркерный ген, а не трансформированные - нет. Выращивая клетки в присутствии антибиотика или химического вещества, которое выбирает или маркирует клетки, экспрессирующие этот ген, можно отделить модифицированные клетки от немодифицированных. Другой метод скрининга включает в себя ДНК-зонд, который прикрепляется только к встроенному гену. Эти маркеры обычно присутствуют в трансгенном организме, хотя был разработан ряд стратегий, позволяющих удалить селектируемый маркер из зрелого трансгенного растения.
Обнаружение того, что рекомбинантный организм содержит вставленных генов обычно недостаточно, чтобы гарантировать, что они будут надлежащим образом экспрессироваться в предполагаемых тканях. Дальнейшее тестирование с использованием ПЦР, гибридизации по Саузерну и секвенирования ДНК проводится для подтверждения того, что организм содержит новый ген. Эти тесты также могут подтвердить хромосомное расположение и количество копий встроенного гена. После подтверждения методы, которые ищут и измеряют продукты генов (РНК и белок), также используются для оценки экспрессии генов, транскрипции, схем обработки РНК, а также экспрессии и локализации белковых продуктов. К ним относятся северная гибридизация, количественная RT-PCR, вестерн-блот, иммунофлуоресценция, ELISA и фенотипический анализ. При необходимости, потомство организма исследуют, чтобы подтвердить, что трансген и связанный с ним фенотип стабильно наследуются.
Традиционные методы генной инженерии обычно случайным образом вставляют новый генетический материал в геном хозяина. Это может нарушить или изменить другие гены в организме. Были разработаны методы, которые вставляли новый генетический материал в специфические сайты в геноме организма. Ранние методы, нацеленные на определенные участки генома, основывались на гомологичной рекомбинации. Создавая конструкции ДНК, которые содержат матрицу, которая соответствует целевой последовательности генома, возможно, что процессы HR в клетке вставят конструкцию в желаемое место. Использование этого метода на эмбриональных стволовых клетках привело к развитию трансгенных мышей с целевым нокаутом. Также было возможно сбивать гены или изменять паттерны экспрессии гена.
Если жизненно важный ген отключен, он может оказаться летальным для организма. Для изучения функции этих генов использовали сайт-специфические рекомбиназы (SSR). Двумя наиболее распространенными типами являются системы Cre-LoxP и Flp-FRT. Cre-рекомбиназа представляет собой фермент, который удаляет ДНК путем гомологичной рекомбинации между связывающими последовательностями, известными как сайты Lox-P. Система Flip-FRT работает аналогичным образом: рекомбиназа Flip распознает последовательности FRT. Путем скрещивания организма, содержащего сайты рекомбиназы, фланкирующие интересующий ген, с организмом, который экспрессирует SSR под контролем тканеспецифичных промоторов, можно выключить или включить гены только в определенных клетках. Это также использовалось для удаления маркерных генов у трансгенных животных. Дальнейшие модификации этих систем позволили исследователям вызывать рекомбинацию только при определенных условиях, позволяя выключать или экспрессировать гены в желаемое время или стадии развития.
Редактирование генома использует искусственно созданные нуклеазы, которые создают специфические двухцепочечные разрывы в желаемых местах генома. Разрывы подвергаются клеточным процессам репарации ДНК, которые можно использовать для целевого нокаута, коррекции или вставки гена на высоких частотах. Если присутствует донорская ДНК, содержащая соответствующую последовательность (гомологию), то новый генетический материал, содержащий трансген, будет интегрирован в целевой сайт с высокой эффективностью посредством гомологичной рекомбинации. Существует четыре семейства сконструированных нуклеаз: мегануклеазы, ZFN, эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции (TALEN), t он CRISPR / Cas (сгруппированные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы / белок, ассоциированный с CRISPR (например, CRISPR / Cas9). Среди четырех типов TALEN и CRISPR / Cas являются двумя наиболее часто используемыми. Последние достижения направлены на объединение нескольких систем для использования лучших свойств обоих (например, megaTAL, которые представляют собой слияние ДНК-связывающего домена TALE и мегануклеазы). Недавние исследования также были сосредоточены на разработке стратегий для создания нокаута или исправлений гена без создания двухцепочечных разрывов (базовые редакторы).
Мегануклеазы были впервые использованы в 1988 году в клетках млекопитающих. Мегануклеазы - это эндодезоксирибонуклеазы, которые функционируют как рестрикционные ферменты с длинными сайтами узнавания, что делает их более специфичными для своего целевого сайта, чем другие рестрикционные ферменты. Это увеличивает их специфичность и снижает их токсичность, поскольку они не нацелены на такое большое количество сайтов в геноме. Наиболее изученными мегануклеазами являются семейство LAGLIDADG. Хотя мегануклеазы по-прежнему весьма восприимчивы к связыванию вне мишени, что делает их менее привлекательными, чем другие инструменты редактирования генов, их меньший размер по-прежнему делает их привлекательными, особенно для перспектив вирусной векторизации.
Нуклеазы цинковых пальцев (ZFNs), впервые использованные в 1996 году, обычно создаются путем слияния доменов цинковых пальцев и нуклеазного домена FokI. Таким образом, ZFN обладают способностью расщеплять ДНК в сайтах-мишенях. Путем инженерии домена цинкового пальца для нацеливания на конкретный сайт в геноме можно редактировать геномную последовательность в желаемом месте. ZFN обладают большей специфичностью, но все же обладают потенциалом связываться с неспецифическими последовательностями. Хотя определенное количество расщеплений вне мишени приемлемо для создания трансгенных модельных организмов, они могут не быть оптимальными для всех методов генной терапии человека.
Доступ к коду, управляющему распознаванием ДНК эффекторами, подобными активаторам транскрипции (TALE), в 2009 г. открыл путь к разработке нового класса эффективного редактирования генов на основе TAL. инструменты. TALE, белки, секретируемые патогеном растений Xanthomonas, с большой специфичностью связываются с генами растения-хозяина и инициируют транскрипцию генов, способствующих инфицированию. Инженерная TALE путем слияния ДНК-связывающего ядра с каталитическим доменом FokI-нуклеазы позволила создать новый инструмент дизайнерских нуклеаз - нуклеазу TALE (TALEN). Они обладают одной из важнейших особенностей всех современных инженерных нуклеаз. Из-за наличия повторяющихся последовательностей их сложно сконструировать с помощью стандартной процедуры молекулярной биологии и полагаться на более сложный метод, такой как клонирование по золотым воротам.
В 2011 году была разработана еще одна крупная революционная технология на основе CRISPR / Cas (систематически сгруппированные с короткими палиндромными повторами / ассоциированный с CRISPR белок) системы, которые функционируют как адаптивная иммунная система у бактерий и архей. Система CRISPR / Cas позволяет бактериям и архейам бороться с вторгающимися вирусами, расщепляя вирусную ДНК и вставляя части этой ДНК в свой собственный геном. Затем организм транскрибирует эту ДНК в РНК и объединяет эту РНК с белками Cas9, чтобы образовать двухцепочечные разрывы во вторгающейся вирусной ДНК. РНК служит направляющей РНК, чтобы направить фермент Cas9 в правильное место в ДНК вируса. Спаривая белки Cas с разработанной направляющей РНК, CRISPR / Cas9 можно использовать для индукции двухцепочечных разрывов в определенных точках в последовательностях ДНК. Разрыв восстанавливается ферментами репарации клеточной ДНК, что в большинстве случаев создает небольшую мутацию типа вставки / удаления. Нацеленная репарация ДНК возможна путем предоставления донорской ДНК-матрицы, которая представляет желаемое изменение и которая (иногда) используется для репарации двухцепочечных разрывов путем гомологичной рекомбинации. Позже было продемонстрировано, что CRISPR / Cas9 может редактировать человеческие клетки в чашке. Хотя раннему поколению не хватает специфики TALEN, основным преимуществом этой технологии является простота конструкции. Это также позволяет одновременно использовать несколько сайтов, что позволяет редактировать сразу несколько генов. CRISPR / Cpf1 - это недавно обнаруженная система, которая требует другой направляющей РНК для создания определенных двухцепочечных разрывов (оставляет выступы при расщеплении ДНК) по сравнению с CRISPR / Cas9.
CRISPR / Cas9 эффективен при разрушении генов. Создание детей, устойчивых к ВИЧ, китайским исследователем Хэ Цзянькуй, пожалуй, самый известный пример нарушения генов с помощью этого метода. Он гораздо менее эффективен при генной коррекции. Методы редактирования оснований находятся в стадии разработки, в которых эндонуклеаза Cas 9 или родственный фермент используется для нацеливания на гены, в то время как связанный фермент дезаминаза производит целенаправленное изменение основания в ДНК. The most recent refinement of CRISPR-Cas9 is called Prime Editing. This method links a reverse transcriptase to an RNA-guided engineered nuclease that only makes single-strand cuts but no double-strand breaks. It replaces the portion of DNA next to the cut by the successive action of nuclease and reverse transcriptase, introducing the desired change from an RNA template.
