Войти
Внеклеточные везикулы (EV) - это липидные бислои -деленные частицы, которые естественным образом высвобождаются из ячейка и, в отличие от ячейки, не может реплицироваться. EV варьируются в диаметре от размера, близкого к размеру минимально возможной физически однослойной липосомы (около 20-30 нанометров ), до 10 микрон или более, хотя подавляющее большинство электромобилей меньше 200 нм. Они несут груз белков, нуклеиновых кислот, липидов, метаболитов и даже органелл от родительских ячейка. Считается, что большинство клеток, которые были изучены на сегодняшний день, выделяют ЭВ, включая некоторые бактериальные, грибковые и растительные клетки, окруженные клеточными стенками.. Было предложено большое количество подтипов ЭВ, определяемых по-разному по размеру, пути биогенеза, грузу, клеточному источнику и функции, что привело к исторически неоднородной номенклатуре, включающей такие термины, как экзосомы и эктосомы.
Были установлены или постулированы многочисленные функции электромобилей. Первые доказательства существования ЭВ были получены с помощью ультрацентрифуги, электронного микроскопа и функциональных исследований коагуляции в середине 20 века. Резкий рост интереса к электромобилям произошел в первом десятилетии 21 века после открытия, что электромобили могут переносить нуклеиновые кислоты, такие как РНК, от клетки к клетке. Связанные с ЭВ из определенных клеток или тканей, нуклеиновые кислоты могут быть легко амплифицированы как маркеры заболевания, а также потенциально могут быть прослежены до клетки происхождения, такой как опухолевая клетка. Это открытие также подразумевало, что электромобили можно использовать в терапевтических целях, таких как доставка нуклеиновых кислот или другого груза в больную ткань. Этот растущий интерес сопровождался созданием компаний и программ финансирования, направленных на разработку ЭМ в качестве биомаркеров или методов лечения заболеваний, основанием Международного общества внеклеточных пузырьков (ISEV) и созданием научного журнала, посвященного в полевых условиях Журнал внеклеточных везикул.
Доказательства существования Впервые электромобили и их функции были собраны путем комбинированного применения ультрацентрифугирования, электронной микроскопии и функциональных исследований в середине 20-го века. Ультрацентрифугированные гранулы из плазмы крови, как сообщалось Эрвином Чаргаффом и в 1946 году, обладали прокоагулянтными свойствами. Липидсодержащая природа этих частиц была дополнительно объяснена. Примерно в то же время и отдельно описаны кальцифицирующие свойства EV в костном матриксе.
Хотя внеклеточные и везикулярные свойства EV были признаны многочисленными группами к 1970-м годам, термин «внеклеточные пузырьки» был впервые использован в названии рукописи в 1971 году. Это электронно-микроскопическое исследование жгутиков пресноводных водорослей 'Ochromonas danica' сообщило о высвобождении ЭВ из мембран, включая мембраны жгутиков. Вскоре после этого было замечено, что ЭВ высвобождаются из фолликулярных клеток щитовидной железы летучей мыши во время пробуждения из гибернации, что указывает на возможное участие ЭВ в эндокринных процессах. Сообщения об ЭВ в образцах кишечных ворсинок и, впервые, в материалах рака человека (аденома ) ссылаются на еще более ранние публикации, которые предоставили аналогичные доказательства, хотя выводы о выпуске ЭВ тогда еще не было нарисовано. EV были также описаны в культуре клеток в кондиционированной среде с различиями между «везикулами мультивезикулярного тела» и «микровезикулами». Эти исследования также отметили сходство ЭМ и вирусов в оболочке.
В начале и середине 1980-х лаборатории и Johnstone разработали более глубокое понимание высвобождения EV из ретикулоцитов, в то же время был достигнут прогресс в отношении EV, выделяемых из опухолевых клеток. В частности, исследование ретикулоцитов показало, что EV могут высвобождаться не только из плазматической мембраны или поверхности клетки, но также путем слияния мультивезикулярного тела с плазматической мембраной. В это время ЭВ были описаны под множеством названий, иногда в одной и той же рукописи, таких как «выделяющиеся везикулы», «фрагменты мембран», «везикулы плазматической мембраны», «микровезикулы / микровезикулы», «экзосомы» (ранее использовались для мобильных, трансформирующих элементов ДНК в модельных организмах Drosophila и Neurospora ), «везикулы включения» и т. д., или упоминаемые органом происхождения, например «простасомы», которые, как было обнаружено, усиливают подвижность сперматозоидов в сперме.
Участие ЭВ в иммунных ответах стало все более очевидным в 1990-х годах с открытиями группы и других исследователей. Клиническое испытание ЭВ, полученных из дендритных клеток, было проведено во Франции незадолго до начала века. Было обнаружено, что клетки иммунной системы способны переносить трансмембранные белки через EV. Например, корецепторы ВИЧ CCR5 и CXCR4 могут быть перенесены из ВИЧ-восприимчивой клетки в рефрактерную клетку с помощью «микрочастиц», в результате чего реципиент клетки допускают заражение.
Начиная с 2006 года, несколько лабораторий сообщили, что ЭМ содержат нуклеиновые кислоты и обладают способностью передавать их от клетки к клетке. Было даже обнаружено, что некоторые РНК функционируют в клетке-реципиенте. Независимо от того, несут ли они РНК, поверхностные молекулы или другие факторы, участие EV в прогрессировании рака вызвало значительный интерес, что привело к гипотезе о том, что определенные EV могут нацеливаться на определенные клетки из-за «кодов», отображаемых на их поверхности; создать или увеличить метастатическую нишу; выдать наличие конкретных раковых образований; или использоваться в качестве терапии для нацеливания на раковые клетки. Между тем были достигнуты успехи в понимании биогенеза и подтипов везикул.
Быстрый рост сообщества исследователей ЭВ в начале 2000-х годов привел к созданию Международного общества внеклеточных везикул (ISEV), что привело к усилиям по строгости и стандартизации в этой области, включая создание журнала внеклеточных пузырьков. Также было создано множество национальных и региональных обществ электромобилей. В 2012 году офис директора Национальных институтов здравоохранения США (NIH) объявил о программе финансирования исследований ЭВ и внеклеточной РНК, Консорциум по коммуникации внеклеточной РНК (ERCC), который впоследствии инвестировал>100 миллионов долларов США. в исследованиях электромобилей. Второй раунд финансирования был объявлен в 2018 году. За это время также выросли коммерческие инвестиции в диагностику и лечение электромобилей. разработал несколько методов диагностики рака, частично основанных на РНК EV. является компанией с интеллектуальной собственностью в области рака поджелудочной железы.
Были предложены различные подтипы ЭВ с такими названиями, как эктосомы, микровезикулы, микрочастицы, экзосомы и др. Эти подтипы EV были определены различными, часто частично совпадающими определениями, основанными в основном на биогенезе (клеточный путь, идентичность клетки или ткани, условие происхождения). Однако подтипы EV могут также определяться размером, составляющими молекулами, функцией или методом разделения. Из-за сбивающих с толку, а иногда и противоречивых определений различных подтипов EV, текущий научный консенсус состоит в том, что «внеклеточные пузырьки» и их вариации являются предпочтительной номенклатурой, если не может быть продемонстрировано конкретное биогенетическое происхождение. Подтипы электромобилей могут быть определены:
"а) физическими характеристиками электромобилей, такими как размер (" малые электромобили "(sEV) и" средние / большие электромобили "(м / 110)) с определенными диапазонами, например, соответственно <100nm or <200nm [small], or>200 нм [большой и / или средний]) или плотности (низкий, средний, высокий, с каждым определенным диапазоном); b) биохимический состав (CD63 + / CD81 + - EV, EV, окрашенные аннексином A5 и т. д.); или c) описания состояний или клеток происхождения (EV подоцитов, гипоксические EV, апоптотические тельца). «
Термины« эктосома »,« микровезикула » (MV) и «микрочастица» (MP) относятся к частицам, высвобождаемым с поверхности клеток. MP был стандартной номенклатурой, особенно в области исследования тромбоцитов. Формирование эктосом может в одних случаях быть результатом направленных процессов, а в других - из-за сил сдвига или прилипания ПМ к поверхности.
Биогенез экзосом начинается с защемления эндосомных инвагинаций в мультивезикулярном теле (MVB) с образованием внутрипросветных пузырьков (ILV). Если MVB сливается с плазматической мембраной, ILV выделяются в виде «экзосом». Первая публикация, в которой термин «экзосома» использовалась для ЭВ, представила его как синоним «микровезикулы». Этот термин также использовался для электромобилей в пределах определенных диапазонов размеров, электромобилей, разделенных с помощью определенных методов, или даже всех электромобилей.
Апоптотические тельца - это ЭВ, которые высвобождаются умирающими клетками, подвергающимися апоптозу. Поскольку апоптотические клетки имеют тенденцию отображать фосфатидилсерин (PS) во внешнем двойном слое клеточной мембраны, апоптотические тельца имеют тенденцию к экстернализации PS, хотя другие EV также могут это делать. Апоптотические тела могут быть довольно большими (в диаметре в микронах), но могут также иметь размеры в субмикронном диапазоне.
Помимо очень больших ЭВ, высвобождаемых во время апоптоза, ЭВ микронного размера могут продуцироваться раковыми клетками, нейронами и другими клетками. Когда эти частицы продуцируются раковыми клетками, они называются «большими онкосомами» и могут достигать 20 микрон и более в диаметре. Эти большие электромобили практически представляют собой клетки, за исключением того, что у них нет полных ядер. Они содержат функциональный цитоскелет и источники энергии (митохондрии) и могут быть подвижными, способствуя метастазированию. Другой класс больших ЭВ наблюдался в нейронах модельного организма C. elegans. При инъекции красителя было замечено, что нейроны изолируют краситель в части клетки и высвобождают ее в большом ЭМ, получившем название «экзофер». Предполагалось, что это тело является механизмом удаления нежелательного клеточного материала. Технически, тромбоциты некоторых позвоночных (которые зачаток от мегакариоцитов ), а также эритроциты (например, взрослых людей) также соответствуют общепринятому определению ЭМ.
Вирусы в оболочке представляют собой тип ЭМ, продуцируемый под влиянием вирусной инфекции. То есть вирион состоит из клеточных мембран, но содержит белки и нуклеиновые кислоты, полученные из вирусного генома. Некоторые вирусы в оболочке могут инфицировать другие клетки даже без функционального вириона, когда геномный материал передается через электромобили. Некоторые вирусы без оболочки также могут воспроизводиться с помощью электромобилей.
«Экзомер» - это недавно обнаруженный тип частиц, который может быть связан с электромобилями. в диапазоне размеров малых EV (разделенных асимметричным фракционированием поля потока), связь экзомеров с EV еще предстоит выяснить.
Изучение ЭМ и их груза обычно требует отделения от биологической матрицы (например, сложной жидкости или ткани), чтобы можно было проанализировать уникальные компоненты ЭМ. Было использовано множество подходов, включая дифференциальное ультрацентрифугирование, ультрацентрифугирование в градиенте плотности, эксклюзионную хроматографию, ультрафильтрацию и методы аффинного / иммуноаффинного захвата. Каждый метод имеет свои собственные результаты извлечения и чистоты: то есть, какой процент входных EV получается, и соотношение «истинных» компонентов EV к совместно изолированным. На разделение EV также могут влиять преаналитические переменные.
Отдельные или сконцентрированные популяции EV можно охарактеризовать несколькими способами. Общая концентрация молекул в таких категориях, как белок, липид или нуклеиновая кислота. Общее количество частиц в препарате также можно оценить, например, методами светорассеяния. Каждая технология измерения может иметь определенный диапазон размеров для точного количественного определения и очень маленькие EV (<100 nm diameter) are not detected by many technologies. Molecular “fingerprints” of populations can be obtained by “omics” technologies like proteomics, lipidomics, and RNomics, or by techniques like Рамановская спектроскопия. Общие уровни уникальных молекул также могут быть измерены в популяции, например тетраспанинов, фосфатидилсерин, или разновидности РНК. Было предложено, что чистоту препарата EV можно оценить путем изучения отношения одного измерения на уровне популяции к другому, например отношения общего белка или общего липида к всего частиц.
Для изучения ЭМ на уровне отдельных частиц необходимы специальные методы. Задача любого предполагаемого метода одночастичных частиц состоит в том, чтобы идентифицировать индивидуальный ЭВ как единичный, липидно-двухслойная частица, и для предоставления дополнительной информации, такой как размер, поверхностные белки или содержание нуклеиновых кислот. Методы, которые успешно использовались для анализа одиночного EV, включают оптическую микроскопию и проточную цитометрию (для больших EV обычно>200 нм), электронная микроскопия (нет л границы), одночастичной интерферометрической отражательной томографии (до 40 нм) и нанопоточной цитометрии (также до 40 нм). Некоторые технологии позволяют изучать отдельные ЭМ без обширного предварительного отделения от биологической матрицы: например, электронная микроскопия и проточная цитометрия.
Для демонстрации присутствия ЭВ в препарате, а также относительного истощения неэтилированных частиц или молекул, используются обогащенные ЭВ и обедненные ЭВ маркеры. необходимо: например, рекомендации MISEV2018 рекомендуют:
Обычно, но не обязательно, маркеры, обогащенные или истощенные EV, представляют собой белки, которые можно обнаружить с помощью вестерн-блоттинга, ELISA, масс-спектрометрии или других широко доступных методов. Считается, что анализ истощенных маркеров особенно важен, поскольку в противном случае нельзя утверждать о чистоте препарата EV. Однако большинство исследований ЭМ до 2016 г. не подтверждали утверждения о наличии ЭМ, показывая обогащенные маркеры и <5% measured the presence of possible co-isolates/contaminants. Despite the high need, a list of EV contaminants is not yet available to the EV research community. A recent study suggested density-gradient-based EV separation from biofluids as an experimental set-up to compile a list of contaminants for EV, based upon differential analysis of EV-enriched fractions versus soluble protein-enriched fractions. Soluble proteins in blood, the белок Тамма-Хорсфалла (уромодулин) в моче или белки ядра, аппарат Гольджи, эндоплазматический ретикулум или митохондрии в эукариотических клетках. Последние белки могут быть обнаружены в больших ЭМ или вообще в любых ЭМ, но ожидается, что они будут меньше концентрироваться в ЭМ, чем в клетке.
Широкое разнообразие биологических функции были приписаны электромобилям.
EV, как полагают, играют роль в распространении различных заболеваний. Исследования показали, что опухолевые клетки посылают электромобили для передачи сигнала резидентным клеткам-мишеням, что может привести к инвазии опухоли и метастазированию.
In vitro исследования болезни Альцгеймера показали, что астроциты, накапливающие бета-амилоид, выделяют EV, которые вызывают нейрональный апоптоз. На содержание EV также влияет воздействие бета-амилоида, и более высокое значение ApoE было обнаружено в EV, секретируемых астроцитами, подвергшимися воздействию бета-амилоида.
