Войти
Принципиальная схема комбинированной экспериментальной установки ECD FTICRMS и IRMPD Диссоциация с захватом электронов (ECD ) представляет собой метод фрагментация ионов в газовой фазе для выяснения структуры пептидов и белков в тандемной масс-спектрометрии. Это один из наиболее широко используемых методов активации и диссоциации выбранного по массе иона-предшественника в МС / МС. Он включает прямое введение электронов низкой энергии в захваченные ионы газовой фазы.
Диссоциация с захватом электронов была разработана Роман Зубарев и Нил Келлехер в лаборатории Фреда Маклафферти в Корнельском университете. Облучение ионов мелиттина 4+ и убиквитина 10+ (захваченных в ячейке FT-MS) лазерными импульсами приводило не только к своеобразной c ', z-фрагментации, но и к снижению заряда. Было высказано предположение, что если ячейка FT модифицируется для одновременного захвата катионов и электронов, вторичные электроны, испускаемые УФ-фотонами, увеличивают эффект уменьшения заряда и c ', z • фрагментацию. Замена УФ-лазера источником ЭУ привела к развитию этой новой техники.
Диссоциация с захватом электронов обычно включает в себя многократно протонированную молекулу M, взаимодействующую со свободным электроном с образованием нечетного электрона. ион. Высвобождение электрической потенциальной энергии приводит к фрагментации иона-продукта.
![{\displaystyle [{\ce {M}}+n{\ce {H}}]^{n+}+{\ce {e^- ->}} {\ bigg [} [{\ ce {M}} + n {\ ce {H}} ] ^ {(n-1) +} {\ bigg]} ^ {*} {\ ce {->фрагменты}}}]( https: // wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/dd1f411d723beadf4167d1a987ba03853363fa7f)
.Скорость диссоциации захвата электронов зависит не только от частоты реакций ион-электронной фрагментации, но и от количества ионов в Объем ион-электронного взаимодействия. Плотность электронного тока и поперечное сечение ECD прямо пропорциональны частоте фрагментации. Катод-дозатор с косвенным нагревом, используемый в качестве источника электронов, приводит к большему электронному току и большей площади эмиттирующей поверхности.
Устройства ECD могут быть две формы. Он может улавливать ионы анализируемого вещества во время стадии ECD или может подвергаться проточному режиму, в котором происходит диссоциация, когда ионы анализируемого вещества непрерывно проходят через область ECD. Проточный режим имеет преимущество перед другими режимами, поскольку используется почти весь пучок ионов аналита. Однако это снижает эффективность ECD для проточного режима.
ECD производит значительно различные типы фрагментных ионов (хотя в ECD в основном были идентифицированы b-ионы c- и z-типа), чем другие MS / Методы MS-фрагментации, такие как диссоциация с отрывом электрона (EDD) (в основном типы a и x), индуцированная столкновением диссоциация (CID) (в основном типы b и y) и инфракрасная многофотонная диссоциация. CID и IRMPD тем или иным образом вносят внутреннюю колебательную энергию, вызывая потерю посттрансляционных модификаций во время фрагментации. В ECD наблюдаются уникальные фрагменты (и дополнительные к CID), и способность эффективно фрагментировать макромолекулы целиком является многообещающей.
Хотя ECD в основном используется в масс-спектрометрии с ионно-циклотронным резонансом с преобразованием Фурье, исследователи показали, что она успешно использовалась в масс-спектрометре с ионной ловушкой. ECD может также выполнять быструю интеграцию нескольких сканирований в FTICR-MS, если использовать его в сочетании с внешним накоплением.
ECD - это недавно представленный метод фрагментации MS / MS, который все еще исследуется. Механизм ECD все еще обсуждается, но, по-видимому, он не обязательно разрушает самую слабую связь и поэтому считается быстрым процессом (неэргодическим ), когда энергия не может расслабляться внутримолекулярно. Были сделаны предположения, что радикальные реакции, инициированные электроном, могут быть ответственны за действие ECD. В аналогичном методе фрагментации МС / МС, называемом диссоциация с переносом электрона, электроны переносятся за счет столкновения между катионами аналита и анионами реагентов.
ECD сам по себе и в сочетании с другими MS очень полезен для белков и пептидов, содержащих множественные дисульфидные связи. FTICR в сочетании с ECD помогает распознавать пептиды, содержащие дисульфидные связи. ECD также может получить доступ к важной информации о последовательности путем активации более заряженных белков. Более того, расщепление дисульфидной связи происходит за счет ECD многозарядных белков или пептидов, продуцируемых ESI. Захват электрона этими белками высвобождает атом H, захваченный дисульфидной связью, вызывая его диссоциацию.
ECD с активацией на основе ультрафиолетового излучения увеличивает покрытие нисходящей последовательностью МС белков, содержащих дисульфидную связь, и гомолитически расщепляет дисульфидную связь с образованием двух отдельных тиоловых радикалов. Этот метод наблюдался с инсулином и рибонуклеазой, что привело к их расщеплению до трех дисульфидных связей и увеличению охвата последовательности.
Фрагменты ECD-MS могут сохранять посттрансляционные модификации, такие как карбоксилирование, фосфорилирование и O-гликозилирование. РДРВ может выполнять нисходящую c характеристика основных типов посттрансляционных модификаций белков. Он успешно разорвал 87 из 208 связей в основной цепи и предоставил первую прямую характеристику фосфопротеина, бычьего β-казеина, одновременно ограничивая расположение пяти сайтов фосфорилирования. Он имеет преимущества перед CAD в измерении степени фосфорилирования с минимальным количеством потерь фосфатов и в картировании фосфопептидов / фосфопротеинов, что делает ECD превосходным методом.
Схематическая диаграмма источника диссоциации электронного захвата атмосферного давления (AP-ECD) ECD было объединено с капиллярным электрофорезом (CE), чтобы получить представление о структурном анализе смеси пептидов и расщепленного белка. Микро-ВЭЖХ в сочетании с ECD FTICR использовали для анализа пепсинового переваривания цитохрома с. Метки последовательности были получены путем анализа смеси пептидов и триптического гидролизата бычьего сывороточного альбумина при использовании LC ECD FTICR MS. Кроме того, LC-ECD-MS / MS обеспечивает более длинные теги последовательностей, чем LC-CID-MS / MS, для идентификации белков. Устройства ECD, использующие радиочастотную квадрупольную ионную ловушку, актуальны для высокопроизводительной протеомики. В последнее время метод диссоциации с захватом электронов при атмосферном давлении (AP-ECD) становится более эффективным методом, поскольку он может быть реализован как автономное устройство с источником ионов и не требует какой-либо модификации основного прибора.
Анализ белков может быть выполнен с использованием подхода сверху вниз или снизу вверх. Однако лучший охват последовательности обеспечивается нисходящим анализом. Комбинация ECD с FTICR MS привела к популярности этого подхода. Это также помогло в определении множественных сайтов модификации в интактных белках. Диссоциация с естественным захватом электронов (NECD) была использована для изучения димера цитохрома c и недавно была использована для выяснения железосвязывающих каналов в ферритине селезенки лошади.
ECD исследования полиалкенгликолей, полиамиды, полиакрилаты и сложные полиэфиры полезны для понимания состава образцов полимеров. Это стало мощным методом анализа структурной информации об ионах-предшественниках во время МС / МС для синтетических полимеров. Тенденция к разрыву одинарной связи ECD делает интерпретацию сканирований продуктовых ионов простой и легкой для химии полимеров.
