Имена | |
---|---|
Систематическое название IUPAC 1-этил-1-нитрозомочевина | |
Другие имена
| |
Идентификаторы | |
Номер CAS | |
3D-модель (JSmol ) | |
Сокращения | ENU |
Ссылка Beilstein | 1761174 |
ChEBI | |
ChEMBL |
|
ChemSpider | |
ECHA InfoCard | 100.010.975 |
Номер EC |
|
KEGG | |
PubChem CID | |
номер RTECS |
|
UNII | |
номер ООН | 2811 |
приборная панель CompTox (EPA ) | |
InChI
| |
УЛЫБАЕТСЯ
| |
Свойства | |
Химическая формула | C3H7N3O2 |
Молярная масса | 117,108 г · моль |
log P | 0,208 |
Кислотность (pK a) | 12,317 |
Основность (pK b) | 1,680 |
Опасности | |
Пиктограммы GHS | |
Сигнальное слово GHS | Опасно |
Краткая характеристика опасности GHS | H301, H312, H332, H350, H360 |
Меры предосторожности GHS | P280, P308 + 313 |
Летальная доза или концентрация (LD, LC): | |
LD50(средняя доза ) | 300 мг кг (перорально, крыса) |
Родственные соединения | |
Родственные мочевины | |
Родственные соединения | |
Если не указано иное, данные приведены для материалов в их стандартном состоянии (при 25 ° C [77 ° F], 100 кПа). | |
N (что такое ?) | |
Ссылки в ink | |
ENU, также известные как N-этил-N- нитрозо мочевина (химическая формула C 3H7N3O2), является сильнодействующим мутагеном. Для данного гена у мышей ENU может индуцировать 1 новую мутацию в каждых 700 локусах. Он также токсичен в высоких дозах.
Химическое вещество является алкилирующим агентом и действует путем переноса этильной группы ENU на азотистые основания (обычно тимин ) в нуклеиновых кислотах. Его основными мишенями являются сперматогониальные стволовые клетки, из которых происходят зрелые сперматозоиды.
Билл Рассел (1951) создал веху в области генетики мышей, создав специально разработанную линию мышей, T (тестовую) основу, которая была использована в генетических скринингах для тестирования мутагенов, таких как радиация и химические вещества. Мышь T-stock имеет 7 рецессивных жизнеспособных мутаций, влияющих на легко узнаваемые признаки. Первоначальной целью Рассела в Национальной лаборатории Ок-Ридж было определение скорости наследственных генных мутаций в зародышевой линии, вызванных излучением. Таким образом, он решил использовать мышей T-stock, чтобы определить, как часто набор локусов может мутировать с помощью излучения. Поскольку мутации у T-stock мышей были рецессивными, потомство будет иметь фенотип дикого типа (в результате скрещивания мутанта [egs / s мутантного самца] с дикий тип самка [+ / +]). Таким образом, любое потомство, несущее мутацию, индуцированную излучением в одном из 7 локусов, будет проявлять мутантный фенотип в самом первом поколении. Этот подход, тест специфического локуса (SLT), позволил Расселу изучить широкий спектр специфических мутаций и рассчитать частоту мутаций, вызванных радиацией.
Помимо изучения влияния радиации на SLT, Russell et al.. были также заинтересованы в изучении влияния химических мутагенов, таких как прокарбазин и этилнитрозомочевина, на SLT. В то время прокарбазин был самым мощным химическим мутагеном, который, как известно, вызывал значительный сперматогониальный мутагенез в SLT, хотя и со скоростью, равной одной трети от рентгеновских лучей. Ранние работы Рассела по мутагенезу на дрозофиле с использованием диэтилнитрозоамина (DEN) побудили их использовать DEN для SLT. Однако DEN необходимо ферментативно преобразовать в алкилирующий агент, чтобы он был мутагенным, и, вероятно, этой ферментативной активации было недостаточно у млекопитающих. Это может быть проиллюстрировано чрезвычайно низкой частотой мутаций у мышей, получавших DEN (3 из 60 179 потомков). Чтобы преодолеть эту проблему, Эккехарт Вегель, рассылающий Russell et al., Предложил использовать новый мутаген, N-этил-N-нитрозомочевину (ENU), алкилирующий агент, который не требует метаболизма. Мыши, индуцированные ENU (250 мг / кг), прошли период стерильности в течение 10 недель. После выздоровления 90 самцов скрестили с самками Т-подвой и получили 7584 детеныша. Их результаты показали, что доза 250 мг / кг ENU способна вызывать частоту мутаций в 5 раз выше, чем полученная при 600R (1R = 2,6 x10 ^ -4 кулонов / кг) острого рентгеновского облучения. Этот показатель также был в 15 раз выше, чем при использовании прокарбазина (600 мг / кг).
Чтобы преодолеть проблему начального периода бесплодия, группа Рассела показала, что вместо инъекции одной большой дозы ENU, фракционированная доза (100 мг / кг) по недельному графику позволяла переносить общую более высокую дозу (300–400 мг / кг). Это также показало, что частота мутаций увеличилась в 12 раз по сравнению с рентгеновскими лучами, в 36 раз по сравнению с прокарбазином и более чем в 200 раз по сравнению со спонтанными мутациями. Когда частота мутаций была усреднена по всем 7 локусам, было обнаружено, что ENU вызывает мутации с частотой по одной на локус на каждые 700 гамет.
С момента открытия ENU как наиболее мощного мутагена Russell et al. он был использован в прямых (основанных на фенотипе) генетических скринингах, с помощью которых можно идентифицировать и изучать фенотип, представляющий интерес. Как показано на рисунке 1, процесс скрининга начинается с мутагенизации мышей-самцов с помощью ENU. Затем следует систематический фенотипический анализ потомства. Потомство оценивают на предмет поведенческих, физиологических или дисморфологических изменений. Выявлен аномальный фенотип. Затем идентификация гена-кандидата достигается посредством позиционного клонирования мутантных мышей с интересующим фенотипом.
Рисунок 2: Типы экранов.ЕНУ используется в качестве генетического инструмента путем разработки множества генетических экранов, отвечающих интересам исследователей. В зависимости от оцениваемой области прямые генетические скрининги могут быть классифицированы, как показано на Рисунке 2, как:
Региональный скрининг можно классифицировать следующим образом:
Рисунок 3: Скрининг без комплементации. В скрининге без комплементации самец, индуцированный ENU, скрещивается с самкой, несущей мутантный аллель (а) интересующего гена ( А). Если мутация доминантная, то она будет присутствовать в каждом поколении. Однако, если мутация рецессивная или если потомство G1 нежизнеспособно, то для идентификации мутации используется другая стратегия. Самец, получавший лечение ENU, скрещивается с самкой дикого типа. Из группы индивидуумов G1 гетерозиготный самец скрещивается с самкой, несущей мутантный аллель (а). Если потомство G2 бесплодно или нежизнеспособно, оно может быть получено снова от самца G1.Комплементация - это явление, которое позволяет генерировать фенотип дикого типа, когда организмы, несущие рецессивные мутации в разных генах скрещиваются. Таким образом, если в организме есть одна функциональная копия гена, то эта функциональная копия способна дополнять мутированную или утерянную копию гена. Напротив, если обе копии гена мутированы или потеряны, это приведет к аллельному отсутствию комплементации (рис. 3) и, таким образом, проявлению фенотипа.
Феномен избыточности объясняет, что часто несколько генов способны компенсировать потерю определенного гена. Однако, если два или более гена, участвующих в одних и тех же биологических процессах или путях, потеряны, это приводит к неаллельному некомплементации. При скрининге без комплементации самец, индуцированный ENU, скрещивается с самкой, несущей мутантный аллель (а) интересующего гена (А). Если мутация доминантная, то она будет присутствовать в каждом поколении. Однако, если мутация рецессивна или если потомство G 1 нежизнеспособно, то для идентификации мутации используется другая стратегия. Самец, получавший лечение ENU, скрещивается с самкой дикого типа. Из группы индивидуумов G 1 гетерозиготный самец скрещивается с самкой, несущей мутантный аллель (а). Если потомство G 2 является бесплодным или нежизнеспособным, его можно снова получить от самца G 1.
Рисунок 4: Экраны удаления. На этом экране мужчин, получавших ENU, скрещивают с гомозиготными женщинами для удаления интересующей области. Потомство G1 представляет собой сложные гетерозиготы по мутации, вызванной ENU. Кроме того, они гаплоидны по отношению к генам в удаленной области, и, таким образом, потеря или усиление функции из-за мутации, индуцированной ENU, экспрессируется доминирующим образом. Таким образом, делеционные скрины имеют преимущество перед другими рецессивными скринингами благодаря идентификации мутации в самом потомстве G1.Делеции на хромосомах могут быть спонтанными или индуцированными. На этом экране мужчин, получавших ENU, скрещивают с женщинами, гомозиготными по удалению интересующей области. Потомство G 1 представляет собой сложные гетерозиготы для мутации, индуцированной ENU (Фиг.4). Кроме того, они гаплоидны по отношению к генам в удаленной области, и, таким образом, потеря или усиление функции из-за мутации, индуцированной ENU, выражается доминирующим образом. Таким образом, делеционные скрины имеют преимущество перед другими рецессивными скринами из-за идентификации мутации в самом потомстве G 1.
Ринчик и др. провели скрининг делеций и анализ комплементации и смогли выделить 11 независимых рецессивных локусов, которые были сгруппированы в семь групп комплементации на хромосоме 7, области, окружающей ген альбиноса (Tyr) и ген розового разведения (p).
Рисунок 5: Экраны балансировщика.Хромосома, несущая балансирующую область, называется балансирующей хромосомой. Балансир - это область, которая предотвращает рекомбинацию между гомологичными хромосомами во время мейоза. Это возможно из-за наличия инвертированной области или серии инверсий. Балансирная хромосома в основном использовалась для исследований в области генетики Drosophila melanogaster. Моника Джастис и др. (2009) эффективно выполнили скрининг балансира, используя балансирующую хромосому, сконструированную Алланом Брэдли и соавт. на хромосоме 11 мыши. На этом скрининге самец, индуцированный ENU, скрещивается с самкой, гетерозиготной по балансирующей хромосоме. У мышей, несущих балансирующую хромосому, желтые уши и хвост. Гетерозиготы G 1 (фиг. 5) скрещиваются с самками, несущими мутацию rex (Rex на фиг. 5), которая дает курчавую шерсть. В G 2 гомозиготы для балансира нежизнеспособны и не восстанавливаются. Мыши, несущие мутацию rex транс к балансировщику или мутацию, индуцированную ENU, имеют курчавую шерсть и выбрасываются. Мыши с мутантом ENU + мутант rex отбрасываются, чтобы предотвратить рекомбинацию между этими двумя хромосомами на следующем этапе размножения, на котором образуются гомозиготные мутанты. Мыши, которые являются составными гетерозиготами по сбалансированности и вызванной ENU мутации, спариваются между братьями и сестрами для получения гомозигот по вызванной ENU мутации в G 3.
полногеномных скринингах чаще всего полезен для изучения генетических заболеваний, в которые могут быть вовлечены множественные генетические и биохимические пути. Таким образом, с помощью этого подхода можно идентифицировать гены-кандидаты или области в геноме, которые связаны с фенотипом.
Рисунок 6: Обычные экраны.Эти скрины могут быть разработаны для выявления простых доминантных и рецессивных фенотипов. (Рисунок 6). Таким образом, индуцированный ENU самец G 0 скрещивается с самкой дикого типа. Потомство G 1 можно подвергнуть скринингу для выявления доминантных мутаций. Однако, если мутация рецессивна, то особи G 3, гомозиготные по мутации, могут быть восстановлены от самцов G 1 двумя способами:
Ряд организаций по всему миру проводят скрининг мутагенеза всего генома с использованием ENU. Некоторые из них включают Институт экспериментальной генетики Немецкого исследовательского центра гигиены окружающей среды (GSF), Мюнхен, Германия; Лаборатория Джексона, Мэн, США; австралийский факультет феноменов Австралийского национального университета, Канберра, Австралия; кафедра нейробиологии и физиологии Северо-Западного университета, Иллинойс, США; Национальная лаборатория Ок-Ридж, Теннесси, США; Совет медицинских исследований (MRC) Харвелл, Оксфордшир, Соединенное Королевство; Отдел генетики Исследовательского института Скриппса, Калифорния, США; Центр мутагенеза мышей по порокам развития при Медицинском колледже Бейлора, Техас, США; и др.
Рисунок 7: Экран модификатора. На экране модификатора выбирается организм с уже существующим фенотипом. Таким образом, скрининг предназначен для выделения мутантов, у которых ранее существовавший интересующий фенотип усиливается или подавляется.Модификаторы, такие как энхансер или супрессор, могут изменять функцию гена. На экране модификаторов выбирается организм с уже существующим фенотипом. Таким образом, любые мутации, вызванные мутагеном (ENU), можно оценить на предмет их усиливающей или подавляющей активности. Скрининг доминантных и рецессивных мутаций проводится аналогично обычному полному геному скринингу (рис. 7). На дрозофиле был проведен ряд экранов-модификаторов. Недавно Алига и др. выполнили скрининг доминантных модификаторов с использованием мышей, индуцированных ENU, для идентификации модификаторов сигнального пути Notch. Дельта 1 является лигандом рецептора Notch. Гомозиготная потеря функции Delta 1 (Dll1) является эмбрионально летальной. Мышей, получавших ENU, скрещивали с гетерозиготами Dll1. В G 1 было получено 35 мутантных линий, в 7 из которых обнаружены модификаторы сигнального пути Notch.
В случае генетических заболеваний с участием нескольких генов, мутации в нескольких генах способствуют прогрессированию заболевания. Однако мутация только в одном из этих генов не может вносить значительный вклад в какой-либо фенотип. Такие «предрасполагающие гены» можно идентифицировать с помощью сенсибилизированных экранов. В этом типе экрана генетический фон или фон окружающей среды изменяются таким образом, чтобы сделать мышь чувствительной к этим изменениям. Идея состоит в том, что предрасполагающие гены могут быть обнаружены на модифицированном генетическом фоне или на фоне окружающей среды. Ринчик и др. провели сенсибилизированный скрининг мутантов мыши, предрасположенных к диабетической нефропатии. Мышей лечили ЭНУ на сенсибилизированном фоне диабета 1 типа. У этих диабетических мышей была доминантная мутация акита в гене инсулина-2 (Ins2). У этих мышей развилась альбуминурия, фенотип, который не наблюдался у недиабетических потомков.