Дигидрофолатредуктаза

редактировать

Дигидрофолатредуктаза
PDB 8dfr EBI.jpg Кристаллическая структура дигидрофолатредуктазы печени курицы. Запись PDB 8dfr
Идентификаторы
Номер EC 1.5.1.3
Номер CAS 9002-03-3
Базы данных
IntEnz Просмотр IntEnz
BRENDA BRENDA запись
ExPASy NiceZyme view
KEGG KEGG entry
MetaCyc метаболический путь
PRIAM профиль
PDB структурыRCSB PDB PDBe PDBsum
Онтология генов AmiGO / QuickGO
Дигидрофолатредуктаза
Идентификаторы
СимволDHFR_1
Pfam PF00186
Pfam кланCL0387
InterPro IPR001796
PROSITE PDOC00072
SCOPe 1dhi / SUPFAM
Дигидрофолатредуктаза R67
PDB 2gqv EBI.jpg Структура с высоким разрешением кодируемой плазмидой дигидрофолатредуктазы из E.coli. Запись PDB 2gqv
Идентификаторы
СимволDHFR_2
Pfam PF06442
InterPro IPR009159
SCOPe 1vif / SUPFAM
DHFR
дигидрофолатредуктазы 1DRF.png
Доступные структуры
PDB Поиск ортолога: PDBe RCSB
Идентификаторы
Псевдонимы DHFR, DHFRP1, DYR, дигидрофолатредуктаза
Внешние идентификаторыOMIM: 126060 MGI: 94890 ГомологГен: 56470 GeneCards : DHFR
Местоположение гена (человек)
Хромосома 5 (человека)
Chr. Хромосома 5 (человек)
Хромосома 5 (человека) Геномное расположение DHFR Геномное расположение DHFR
Полоса 5q14.1Начало80,626,226 bp
Конец80,654,983 bp
Orthologs
SpeciesЧеловекMouse
Entrez

1719

13361

Ensembl

ENSG00000228716

ENSMUSG00000021707

UniProt

P00374

P00375

RefSeq (мРНК)

NM_000791. NM_001290354. NM_001290357

NM_010049

RefSe q (белок)

NP_000782. NP_001277283. NP_001277286

NP_034179

Местоположение (UCSC)Chr 5: 80,63 - 80,65 Мб Chr 13: 92,35 - 92,39 Мб
PubMed поиск
Викиданные
Просмотр / редактирование человека Просмотр / редактирование мыши

Дигидрофолатредуктаза, или DHFR, является ферментом который восстанавливает дигидрофолиевую кислоту до тетрагидрофолиевой кислоты, используя NADPH в качестве донора электронов, который может быть преобразован в виды тетрагидрофолата кофакторы, используемые в химии переноса 1-углерода. У человека фермент DHFR кодируется геном DHFR . Он обнаружен в области q11 → q22 хромосомы 5. Бактериальные виды обладают отдельными DHFR ферментами (на основе их паттерна связывания диаминогетероциклических молекул), но млекопитающие DHFR очень похожи.

Содержание

  • 1 Структура
  • 2 Функция
  • 3 Механизм
    • 3.1 Общий механизм
    • 3.2 Конформационные изменения DHFR
    • 3.3 R67 DHFR
  • 4 Клиническая значимость
  • 5 Терапевтические применения
    • 5.1 Возможное лечение сибирской язвы
  • 6 В качестве инструмента исследования
    • 6.1 Клетки СНО
  • 7 Взаимодействия
  • 8 Интерактивная карта путей
  • 9 Ссылки
  • 10 Дополнительная литература
  • 11 Внешние ссылки

Структура

Центральный восьмицепочечный бета-складчатый лист составляет главную особенность полипептида складывания основной цепи DHFR. Семь из этих нитей параллельны, а восьмая - антипараллельно. Четыре альфа-спирали соединяют последовательные бета-цепи. Остатки 9-24 называются «Met20» или «петля 1» и, наряду с другими петлями, являются частью основного субдомена, который окружает активный сайт. активный сайт расположен в N-концевой половине последовательности, которая включает консервативную Pro - Trp дипептид; Было показано, что триптофан участвует в связывании субстрата ферментом.

Функция

Дигидрофолат редуктаза превращает дигидрофолат в тетрагидрофолат, протонный челнок, необходимый для синтеза de novo пуринов, тимидиловой кислоты и некоторых аминокислоты. В то время как функциональный ген дигидрофолатредуктазы был картирован на хромосоме 5, на отдельных хромосомах были идентифицированы множественные безинтронные обработанные псевдогены или гены, подобные дигидрофолатредуктазе.

Обнаруженный во всех организмах, DHFR играет важную роль в регулировании количества тетрагидрофолата в клетке. Тетрагидрофолат и его производные необходимы для синтеза пурина и тимидилата, которые важны для пролиферации и роста клеток. DHFR играет центральную роль в синтезе предшественников нуклеиновых кислот, и было показано, что мутантным клеткам, которые полностью лишены DHFR, для роста требуются глицин, аминокислота и тимидин. DHFR также был продемонстрирован как фермент, участвующий в восстановлении тетрагидробиоптерина из дигидробиоптерина

Механизм

Восстановление дигидрофолата до тетрагидрофолата, катализируемое DHFR.

Общий механизм

DHFR катализирует перенос гидрида из НАДФН в дигидрофолат с сопутствующим протонированием с образованием тетрагидрофолата. В конце концов, дигидрофолат восстанавливается до тетрагидрофолата, а НАДФН окисляется до НАДФ +. Высокая гибкость Met20 и других петель рядом с активным центром играет роль в стимулировании высвобождения продукта, тетрагидрофолата. В частности, петля Met20 помогает стабилизировать никотинамидное кольцо НАДФН, способствуя передаче гидрида от НАДФН к дигидрофолату.

DHFR (петля Met20) + НАДФН + фолат

Механизм действия этого фермента постепенный и устойчивый - состояние случайное. В частности, каталитическая реакция начинается с присоединения НАДФН и субстрата к сайту связывания фермента с последующим протонированием и переносом гидрида от кофактора НАДФН к субстрату. Однако два последних шага не выполняются одновременно в одном и том же переходном состоянии. В исследовании с использованием вычислительных и экспериментальных подходов Лю и др. Пришли к выводу, что стадия протонирования предшествует переносу гидрида.

Замкнутая структура изображена красным цветом, а закрытая структура изображена зеленым на каталитической схеме. В структуре DHF и THF окрашены в красный цвет, NADPH окрашены в желтый цвет, а остаток Met20 окрашен в синий цвет

Показано, что ферментативный механизм DHFR зависит от pH, в частности, стадия переноса гидрида, поскольку показано, что изменения pH оказывают заметное влияние от электростатики активного центра и состояния ионизации его остатков. Кислотность целевого азота на субстрате важна для связывания субстрата с сайтом связывания фермента, который, как доказано, является гидрофобным, даже если он имеет прямой контакт с водой. Asp27 - единственный заряженный гидрофильный остаток в сайте связывания, и нейтрализация заряда на Asp27 может изменить pKa фермента. Asp27 играет решающую роль в каталитическом механизме, помогая протонировать субстрат и удерживая субстрат в конформации, благоприятной для переноса гидрида. Показано, что стадия протонирования связана с таутомеризацией енола, хотя это превращение не считается благоприятным для донорства протона. Доказано участие молекулы воды в стадии протонирования. Вступление молекулы воды в активный центр фермента облегчается петлей Met20.

Конформационные изменения DHFR

Каталитический цикл реакции, катализируемой DHFR, включает пять важных промежуточных соединений: холофермент (E: NADPH), комплекс Михаэлиса (E: NADPH: DHF), комплекс тройных продуктов (E: NADP: THF), бинарный комплекс тетрагидрофолата (E: THF) и комплекс THF complexNADPH (E: NADPH: THF). Этап диссоциации продукта (THF) от E: NADPH: THF до E: NADPH является этапом, определяющим скорость во время стационарного оборота.

Конформационные изменения имеют решающее значение для каталитического механизма DHFR. Петля Met20 DHFR способна открывать, закрывать или закрывать активный сайт. Соответственно, Met20 присваиваются три различные конформации, классифицируемые как открытое, закрытое и закрытое состояния. Кроме того, была определена дополнительно искаженная конформация Met20 из-за нечетких результатов характеризации. Петля Met20 наблюдается в закрытой конформации в трех промежуточных продуктах лигирования, где никотинамидное кольцо закрыто от активного сайта. Эта конформационная особенность объясняет тот факт, что замена NADP на NADPH предшествует диссоциации продукта. Таким образом, следующий раунд реакции может происходить при связывании субстрата.

Сравнение кинетики реакции между EcDHFR и R67 DHFR Структурные различия связывания субстрата в E. coli и R67 DHFR

R67 DHFR

Благодаря своей уникальной структуре и каталитическим свойствам R67 DHFR широко изучается. R67 DHFR представляет собой DHFR, кодируемый R-плазмидой типа II, не имеющий генетической и структурной связи с хромосомным DHFR E. coli. Это гомотетрамер, обладающий симметрией 222 с одной порой активного центра, которая подвергается воздействию растворителя [ноль]. Эта симметрия активного центра приводит к другому способу связывания фермента: он может связываться с двумя молекулами дигидрофолата (ДГФ) с положительная кооперативность или две молекулы НАДФН с отрицательной кооперативностью, или один субстрат плюс один, но только последний обладает каталитической активностью. По сравнению с хромосомным DHFR E. coli, он имеет более высокий K m в связывании дигидрофолата (DHF) и NADPH. Гораздо более низкая каталитическая кинетика показывает, что перенос гидрида является стадией, определяющей скорость, а не высвобождением продукта (THF).

В структуре R67 DHFR гомотетрамер образует поры с активным центром. В каталитическом процессе ДГФ и НАДФН попадают в поры из противоположного положения. Π-π-стэкинг-взаимодействие между никотинамидным кольцом НАДФН и птеридиновым кольцом DHF плотно соединяет два реагента в активном центре. Однако при связывании наблюдалась гибкость пара-аминобензоилглутаматного хвоста DHF, что может способствовать образованию переходного состояния.

Клиническая значимость

была связана с мегалобластной анемией. Лечение проводится с помощью восстановленных форм фолиевой кислоты. Поскольку тетрагидрофолат, продукт этой реакции, является активной формой фолиевой кислоты у человека, ингибирование DHFR может вызвать функциональную недостаточность фолиевой кислоты. DHFR является привлекательной фармацевтической мишенью для ингибирования из-за его ключевой роли в синтезе предшественников ДНК. Триметоприм, антибиотик, ингибирует бактериальный DHFR, в то время как метотрексат, химиотерапевтический агент, ингибирует DHFR млекопитающих. Однако устойчивость развилась к некоторым лекарствам в результате мутационных изменений в самом DHFR.

Мутации DHFR вызывают редкую аутосомно-рецессивную врожденную ошибку метаболизма фолиевой кислоты, которая приводит к мегалобластам. анемия, панцитопения и тяжелая церебральная недостаточность фолиевой кислоты, которые можно исправить добавлением фолиновой кислоты.

Терапевтические применения

Поскольку фолиевая кислота необходима быстро деляющимся клеткам для производства тимина, этот эффект можно использовать с терапевтической пользой.

DHFR может использоваться при лечении рака и в качестве потенциальной мишени против бактериальных инфекций. DHFR отвечает за уровни тетрагидрофолата в клетке, а ингибирование DHFR может ограничивать рост и пролиферацию клеток, которые характерны для рака и бактериальных инфекций. Метотрексат, конкурентный ингибитор DHFR, является одним из таких противораковых препаратов, которые ингибируют DHFR. Другие препараты включают триметоприм и пириметамин. Эти три широко используются в качестве противоопухолевых и противомикробных средств. Другие классы соединений, которые нацелены на DHFR в целом и бактериальные DHFR в частности, относятся к таким классам, как диаминоптеридины, диаминотриазины, диаминопирролохиназолины, стильбены, халконы, дезоксибензоины и многие другие.

Триметоприм показал, что обладают активностью против различных грамположительных бактериальных патогенов. Однако устойчивость к триметоприму и другим лекарствам, направленным на ДГФР, может возникать из-за множества механизмов, ограничивающих успех их терапевтического применения. Устойчивость может возникать в результате амплификации гена DHFR, мутаций в DHFR, снижения поглощения лекарственных средств, среди прочего. Несмотря на это, триметоприм и сульфаметоксазол в комбинации использовались в качестве антибактериального средства в течение десятилетий.

Фолат необходим для роста, а метаболизм фолиевой кислоты является целью при разработке методов лечения рак. DHFR - одна из таких целей. Было показано, что режим фторурацила, доксорубицина и метотрексата продлевает выживаемость пациентов с распространенным раком желудка. Дальнейшие исследования ингибиторов DHFR могут привести к новым способам лечения рака.

Бактериям также необходим DHFR для роста и размножения, и, следовательно, ингибиторы, селективные в отношении бактериального DHFR, нашли применение в качестве антибактериальных средств.

Классы малых молекул, используемых в качестве ингибиторов дигидрофолатредуктазы, включают диаминохиназолин и диаминопирролохиназолин, диаминопиримидин, диаминоптеридин и диаминотриазины.

Возможное лечение сибирской язвы

Структурное выравнивание дигидрофолатредуктазы из Bacillus anthracis (BaDHFR), Staphylococcus aureus (SaDHFR), Escherichia coli. 639>Дигидрофолатредуктаза из Bacillus anthracis (BaDHFR) - утвержденная лекарственная мишень для лечения инфекционного заболевания, сибирской язвы. BaDHFR менее чувствителен к аналогам триметоприма, чем дигидрофолатредуктаза других видов, таких как Escherichia coli, Staphylococcus aureus и Streptococcus pneumoniae. Структурное выравнивание дигидрофолатредуктазы всех четырех видов показывает, что только BaDHFR имеет комбинацию фенилаланин и тирозин в положениях 96 и 102 соответственно.

Устойчивость BaDHFR к аналогам триметоприма обусловлена ​​этими двумя остатками (F96 и Y102), которые также обеспечивают улучшенную кинетику и каталитическую эффективность. В текущих исследованиях используются мутанты активного сайта в BaDHFR для руководства оптимизацией новых антифолатных ингибиторов.

В качестве инструмента исследования

DHFR использовался в качестве инструмента для обнаружения межбелковых взаимодействий в анализе комплементации белковых фрагментов (PCA).

клетки СНО

DHFR, лишенные клеток СНО, являются наиболее часто используемой клеточной линией для продукции рекомбинантных белков. Эти клетки трансфицируют плазмидой , несущей ген dhfr и ген рекомбинантного белка в единой экспрессионной системе, а затем подвергают селективной условия в среде без тимидина. Выживают только клетки с экзогенным геном DHFR вместе с интересующим геном.

Взаимодействия

Было показано, что дигидрофолатредуктаза взаимодействует с GroEL и Mdm2.

Интерактивная карта путей

Щелкните гены, белки и метаболиты ниже для ссылки на соответствующие статьи.

[[File: FluoropyrimidineActivity_WP1601 [[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]][[]]FluoropyrimidineActivity_WP1601 | {{{bSize}}} px | alt = Фторурацил (5-FU) Активность редактировать ]] Фторурацил (5-FU)) Деятельность редактировать

Ссылки

Дополнительная литература

Внешние ссылки

.

Эта статья включает текст из общедоступного домена Pfam и InterPro : IPR001796 Эта статья включает текст из общедоступного домена Pfam и InterPro : IPR009159
Последняя правка сделана 2021-05-17 06:05:21
Содержание доступно по лицензии CC BY-SA 3.0 (если не указано иное).
Обратная связь: support@alphapedia.ru
Соглашение
О проекте