Войти
Дезоксирибозимы, также называемые ферментами ДНК, ДНКзимами или каталитические ДНК, представляют собой ДНК олигонуклеотиды, которые способны выполнять специфическую химическую реакцию, часто, но не всегда каталитическую. Это похоже на действие других биологических ферментов, таких как белки или рибозимы (ферменты, состоящие из РНК ). Однако, в отличие от обилия белковых ферментов в биологических системах и открытия биологических рибозимов в 1980-х годах, существует лишь небольшое количество доказательств естественного происхождения дезоксирибозимов. Дезоксирибозимы не следует путать с ДНК аптамерами, которые представляют собой олигонуклеотиды, которые избирательно связываются с целевым лигандом, но не катализируют последующую химическую реакцию.
За исключением рибозимов, молекулы нуклеиновых кислот внутри клеток в первую очередь служат для хранения генетической информации из-за их способности образовывать комплементарные пары оснований, что позволяет -правильность копирования и передачи генетической информации. Напротив, молекулы нуклеиновой кислоты более ограничены в своей каталитической способности, по сравнению с белковыми ферментами, всего лишь тремя типами взаимодействий: водородная связь, пи-стэкинг и металл. -ионное согласование. Это связано с ограниченным числом функциональных групп мономеров нуклеиновых кислот : в то время как белки состоят из до двадцати различных аминокислот с различными функциональными группами, нуклеиновые кислоты построены всего из четырех химически подобных азотистых оснований. Кроме того, в ДНК отсутствует 2'- гидроксильная группа, обнаруженная в РНК, что ограничивает каталитическую способность дезоксирибозимов даже по сравнению с рибозимами.
В дополнение к присущей им неполноценности каталитической активности ДНК, очевидное отсутствие встречающихся в природе дезоксирибозимов также может быть связано с в первую очередь двухцепочечной конформацией ДНК в биологических системах, что ограничивает ее физическую гибкость и способность образовывать третичные структуры, и так резко ограничит способность двухцепочечной ДНК действовать как катализатор; хотя есть несколько известных примеров биологической одноцепочечной ДНК, таких как многокопийная одноцепочечная ДНК (msDNA), некоторые вирусные геномы и репликационная вилка образуется при репликации ДНК. Дальнейшие структурные различия между ДНК и РНК также могут играть роль в отсутствии биологических дезоксирибозимов, таких как дополнительная метил группа основания ДНК тимидин по сравнению с основанием РНК урацил или склонность ДНК принимать В-форму спирали, в то время как РНК имеет тенденцию принимать А-форму спирали. Однако было также показано, что ДНК может образовывать структуры, которые РНК не может образовывать, что предполагает, что, хотя существуют различия в структурах, которые каждая может образовывать, ни одна из них по своей природе не является более или менее каталитической из-за их возможных структурных мотивов. 176>1 Типы
Транс-форма (две отдельные цепи) ДНКзима 17E. Большинство рибонуклеазных ДНКзимов имеют сходную форму, состоящую из отдельной ферментной цепи (синий / голубой ) и субстратной цепи (черный ). Два плеча комплементарных оснований фланкируют каталитическое ядро (голубой ) на цепи фермента и единственный рибонуклеотид (красный ) на цепи субстрата. Стрелкой показан сайт расщепления рибонуклеотида. Самым распространенным классом дезоксирибозимов являются рибонуклеазы, которые катализируют расщепление фосфодиэфирной связи рибонуклеотида посредством реакции переэтерификации с образованием 2'3'-циклического фосфатного конца и 5'- гидроксильного конца. Дезоксирибозимы рибонуклеазы обычно подвергаются селекции в виде длинных одноцепочечных олигонуклеотидов, которые содержат одно рибонуклеотидное основание, которое действует как сайт расщепления. После секвенирования эта одноцепочечная «цис» -форма дезоксирибозима может быть преобразована в двухцепочечную «транс» -форму путем разделения субстратного домена (содержащего сайт расщепления рибонуклеотида) и ферментного домена (содержащего каталитическое ядро) на отдельные цепи, которые могут гибридизоваться через два фланкирующих плеча, состоящих из комплементарных пар оснований.
Первым известным дезоксирибозимом была рибонуклеаза, обнаруженная в 1994 г. Рональдом Брейкером в то время как докторант в лаборатории Джеральда Джойса в Исследовательском институте Скриппса. Этот дезоксирибозим, позже названный GR-5, катализирует Pb -зависимое расщепление одиночного рибонуклеотидного фосфоэфира со скоростью более чем в 100 раз по сравнению с некаталитической реакцией. Впоследствии были разработаны дополнительные дезоксирибозимы, расщепляющие РНК, которые включают различные металлы кофакторы, включая Mg -зависимый дезоксирибозим E2 и Са -зависимый дезоксирибозим Mg5. Эти первые дезоксирибозимы были неспособны катализировать полную цепь субстрата РНК, но за счет включения полной цепи субстрата РНК в процесс отбора дезоксирибозимы, которые функционировали с субстратами, состоящими либо из полной РНК, либо из полной ДНК с одним основанием РНК, могли быть использованы.. Первые из этих более универсальных дезоксирибозимов, 8-17 и 10-23, в настоящее время являются наиболее широко изученными дезоксирибозимами. Фактически, было обнаружено, что многие впоследствии открытые дезоксирибозимы содержат тот же самый мотив каталитического ядра, что и 8-17, включая ранее обнаруженный Mg5, что позволяет предположить, что этот мотив представляет собой «простейшее решение проблемы расщепления РНК». ДНКзим 10-23 содержит каталитическое ядро из 15 нуклеотидов, которое фланкируется двумя доменами распознавания субстрата. Этот ДНКзим эффективно расщепляет комплементарные РНК специфическим для последовательности образом между неспаренным пурином и парным пиримидином. ДНКзимы, нацеленные на AU или GU, по сравнению с GC или AC более эффективны. Кроме того, было показано, что скорость расщепления РНК увеличивается после введения интеркаляторов или замены дезоксигуанина на дезоксиинозин в месте соединения каталитической петли. В частности, добавление 2’-O-метильных модификаций к катализатору, как оказалось, значительно увеличивает скорость расщепления как in vitro, так и in vivo. Другими известными дезоксирибозимными рибонуклеазами являются те, которые обладают высокой селективностью в отношении определенного кофактора. В эту группу входят металло-селективные дезоксирибозимы, такие как Pb -специфический 17E, UO2 -специфический 39E и Na -специфический A43. О первой кристаллической структуре ДНКзима сообщалось в 2016 году. В 2018 году были описаны ДНКзимы на основе 10-23 ядер и соответствующие MNAзимы, которые катализируют реакции при температуре окружающей среды, и открывают двери для использования этих ферментов на основе нуклеиновых кислот для многих других приложений без необходимости обогрев.
Эта ссылка и эта ссылка описывает молекулу ДНК 5'-GGAGAACGCGAGGCAAGGCTGGGAGAAATGTGGATCACGATT-3 ', которая действует как дезоксирибозим, который использует свет для восстановления димера тимина, используя серотонин как кофактор.
Особый интерес представляют ДНК лигазы. Эти молекулы продемонстрировали замечательную хемоселективность в реакциях разветвления РНК. Хотя каждая повторяющаяся единица в цепи РНК имеет свободную гидроксильную группу, ДНК-лигаза принимает только одну из них в качестве начальной точки ветвления. Это невозможно сделать с помощью традиционной органической химии.
С тех пор было разработано много других дезоксирибозимов, которые катализируют фосфорилирование ДНК, ДНК аденилирование, ДНК, порфирин металлирование, димер тимина фотореверсия и расщепление ДНК.
Поскольку известные природные дезоксирибозимы не известны, большинство известных дезоксирибозимных последовательностей были обнаружены с помощью высокопроизводительной техники селекции in vitro, аналогичной SELEX. Селекция in vitro использует «пул» большого количества случайных последовательностей ДНК (обычно 10–10 уникальных цепей), которые можно проверить на определенную каталитическую активность. Пул синтезируется посредством твердофазного синтеза, так что каждая цепь имеет две константные области (праймерные сайты связывания для ПЦР-амплификации), фланкирующие случайную область определенной длины, обычно 25–50 оснований. длинный. Таким образом, общее количество уникальных цепей, называемое пространством последовательностей, равно 4, где N обозначает количество оснований в случайной области. Поскольку 4 ≈ 10, нет практических причин для выбора случайных областей длиной менее 25 оснований, в то время как превышение этого числа оснований означает, что полное пространство последовательностей не может быть исследовано. Однако, поскольку существует много потенциальных кандидатов для данной каталитической реакции в пространстве последовательностей, случайные области от 50 и даже выше успешно дали каталитические дезоксирибозимы.
Сначала пул подвергается стадии отбора, во время которой каталитические цепи отделены от некаталитических цепей. Точный метод разделения будет зависеть от катализируемой реакции. Например, на стадии разделения для расщепления рибонуклеотида часто используется аффинная хроматография, в которой биологическая метка, прикрепленная к каждой цепи ДНК, удаляется с любых каталитически активных цепей посредством расщепления рибонуклеотидного основания.. Это позволяет разделить каталитические нити колонкой, которая специфически связывает метку, поскольку неактивные нити будут оставаться связанными с колонкой, в то время как активные нити (которые больше не обладают меткой) проходят через нее. Обычной установкой для этого является тег биотин с аффинной колонкой стрептавидин. Гель-электрофорез может также использоваться для разделения, в котором изменение молекулярной массы количества нитей при реакции расщепления достаточно, чтобы вызвать сдвиг в расположении реактивных цепей на геле. После стадии отбора реактивный пул амплифицируется с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) для регенерации и амплификации реактивных цепей, и процесс повторяется до тех пор, пока не будет получен пул с достаточной реактивностью. Требуется несколько раундов отбора, потому что некоторые некаталитические цепи неизбежно пройдут через любой единственный этап отбора. Обычно для однозначной каталитической активности требуется 4–10 циклов, хотя для более жестких каталитических условий часто требуется больше циклов. После достаточного количества циклов последний пул секвенируется, и отдельные цепи тестируются на их каталитическую активность. Динамику пула можно описать с помощью математического моделирования, которое показывает, как олигонуклеотиды подвергаются конкурентному связыванию с мишенями и как можно улучшить эволюционный результат за счет точной настройки параметров.
Дезоксирибозимы, полученные посредством отбора in vitro, будут оптимизированы для условий во время отбора, таких как концентрация соли, pH и присутствие кофакторов. Из-за этого каталитическая активность только в присутствии определенных кофакторов или других условий может быть достигнута с использованием шагов положительного отбора, а также шагов отрицательного отбора против других нежелательных условий.
Аналогичный способ получения новых дезоксирибозимов осуществляется путем эволюции in vitro. Хотя этот термин часто используется взаимозаменяемо с отбором in vitro, эволюция in vitro более уместно относится к немного другой процедуре, в которой исходный пул олигонуклеотидов генетически изменяется в последующих циклах через генетическую рекомбинацию или через точку . мутации. Для точечных мутаций пул можно амплифицировать с помощью подверженной ошибкам ПЦР для получения множества различных цепей различных случайных одиночных мутаций. Как и в случае отбора in vitro, развитые цепи с повышенной активностью будут иметь тенденцию доминировать в пуле после нескольких этапов отбора, и после достижения достаточной каталитической активности пул можно секвенировать, чтобы идентифицировать наиболее активные цепи.
Исходный пул для эволюции in vitro может быть получен из суженного подмножества пространства последовательностей, такого как определенный раунд эксперимента по селекции in vitro, который иногда также называют повторным отбором in vitro. Первоначальный пул также может быть получен в результате амплификации одной олигонуклеотидной цепи. В качестве примера последнего недавнее исследование показало, что функциональный дезоксирибозим может быть выбран посредством in vitro эволюции некаталитической цепи-предшественника олигонуклеотида. Произвольно выбранный фрагмент ДНК, полученный из транскрипта мРНК бычьего сывороточного альбумина, эволюционировал посредством случайных точечных мутаций в течение 25 раундов отбора. Посредством глубокого секвенирования анализа различных поколений пула можно было отслеживать эволюцию наиболее каталитической цепи дезоксирибозима через каждую последующую одиночную мутацию. Эта первая успешная эволюция каталитической ДНК из некаталитического предшественника может служить подтверждением гипотезы мира РНК. В другом недавнем исследовании рибозим РНК-лигазы был преобразован в дезоксирибозим посредством in vitro эволюции неактивного дезоксирибоаналога рибозима. Новый дезоксирибозим РНК-лигазы содержал всего двенадцать точечных мутаций, две из которых не влияли на активность, и имел каталитическую эффективность примерно 1/10 от исходного рибозима, хотя исследования предположили, что активность может быть далее увеличился за счет дальнейшего отбора. Это первое доказательство передачи функции между разными нуклеиновыми кислотами могло бы подтвердить различные гипотезы пре-РНК-мира.
Поскольку большинство дезоксирибозимов страдают от ингибирования продукта и, таким образом, демонстрируют одно- оборотное поведение, иногда утверждают, что дезоксирибозимы не проявляют «истинного» каталитического поведения, поскольку они не могут подвергаются многооборотному катализу, как и большинство биологических ферментов. Однако общее определение катализатора требует только того, чтобы вещество ускоряло скорость химической реакции, не расходясь в реакции (т. Е. безвозвратно химически изменен и может быть переработан). Таким образом, по этому определению однооборотные дезоксирибозимы действительно являются катализаторами. Кроме того, многие эндогенные ферменты (как белки, так и рибозимы ) также проявляют однооборотное поведение, поэтому дезоксирибозимы не входят в состав ранг «катализатора» просто потому, что он не отличается многооборотным поведением, кажется необоснованным.
Хотя ферменты РНК были открыты раньше ферментов ДНК, последние имеют некоторые явные преимущества. ДНК более рентабельна, и ДНК может быть получена с большей длиной последовательности и может быть получена с более высокой чистотой в твердофазном синтезе. Несколько исследований показали использование ДНКзимов для подавления репликации вирусов гриппа A и B в клетках-хозяевах. Также было показано, что ДНКзимы подавляют репликацию коронавируса SARS (SARS-CoV), респираторно-синцитиального вируса (RSV), риновируса человека 14 и HCV
Астма характеризуется эозинофилами. -индуцированное воспаление, вызванное хелперной Т-клеткой 2 типа (Tdiv class="ht"). Путем воздействия на фактор транскрипции GATA3 пути Tdiv class="ht" с помощью ДНКзима можно нейтрализовать воспаление. Безопасность и эффективность SB010, нового ДНКзима 10-23, была оценена и обнаружена его способность расщеплять и инактивировать информационную РНК GATA3 в клинических испытаниях фазы IIa. Лечение SB010 значительно компенсировало как поздние, так и ранние астматические реакции после обострения аллергена у пациентов мужского пола с аллергической астмой. Фактор транскрипции GATA-3 также представляет собой интересную мишень в составе ДНКзима для местного применения SB012 для новой терапевтической стратегии при язвенном колите (UC). ЯК - это идиопатическое воспалительное заболевание кишечника, характеризующееся хронически рецидивирующим воспалением желудочно-кишечного тракта и характеризующееся поверхностным непрерывным воспалением слизистой оболочки, которое преимущественно поражает толстый кишечник. Пациенты, которые не эффективно реагируют на текущие стратегии лечения ЯК, обладают серьезными недостатками, один из которых может привести к колоректальной хирургии и может привести к серьезному снижению качества жизни. Таким образом, пациенты с умеренным или тяжелым ЯК могут получить значительную пользу от этих новых терапевтических альтернатив, из которых SB012 проходит фазу I клинических испытаний. Атопический дерматит (АД) - это хроническое воспалительное заболевание кожи, при котором пациенты страдают от экземы, часто сильного зуда на пораженной коже, а также от осложнений и вторичных инфекций. БА проявляется в результате активации иммунных ответов, модифицированных Tdiv class="ht", поэтому новый подход БА с использованием ДНКзимов, нацеленных на GATA-3, является вероятным вариантом лечения. ДНКзим SB011 для местного применения в настоящее время проходит II фазу клинических испытаний. Также продолжаются исследования ДНКзима для лечения рака. Разработка ДНКзима 10-23, который может блокировать экспрессию IGF-I (инсулиноподобный фактор роста I, способствующий нормальному росту клеток, а также канцерогенезу), воздействуя на его мРНК, может быть полезной для блокирования секреции IGF- I из первичных клеток простаты, которые в конечном итоге тормозят развитие опухоли простаты. Кроме того, при таком лечении ожидается, что метастазирование в печень также будет подавлено за счет ингибирования IGF-I в печени (основного источника сывороточного IGF-I).
ДНКзимы нашли практическое применение в металлических биосенсорах. Биосенсор на основе ДНКзима для иона свинца был использован для обнаружения иона свинца в воде в государственных школах Сент-Пол в Миннесоте.
Хиральность - еще одно свойство, которое ДНКзим может использовать. ДНК встречается в природе в виде правой двойной спирали, и в асимметричном синтезе хиральный катализатор является ценным инструментом в синтезе хиральных молекул из ахирального источника. В одном случае искусственный ДНК-катализатор был приготовлен путем присоединения к нему иона меди через спейсер. Комплекс медь-ДНК катализирует реакцию Дильса-Альдера в воде между циклопентадиеном и азахалконом. Было обнаружено, что продукты реакции (эндо и экзо) присутствуют в энантиомерном избытке 50%. Позже было обнаружено, что может быть индуцирован 99% энантиомерный избыток, и что как скорость, так и энантиоселективность связаны с последовательностью ДНК.
Другие применения ДНК в химии: синтез по шаблону ДНК, энантиоселективный катализ и вычисления ДНК.
