Войти
Метафазная клетка, положительная по перестройке BCR / ABL с использованием FISH Цитогенетика, по сути, является ветвью генетики, но также является частью клеточной биологии / цитологии (подраздел анатомии человека), который касается того, как хромосомы связаны с поведением клеток, особенно с их поведением во время митоза и мейоз. Используемые методы включают кариотипирование, анализ хромосом с G-полосой, другие методы цитогенетического бэндинга, а также молекулярную цитогенетику, такую как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) и сравнительная геномная гибридизация (CGH).
Хромосомы впервые были обнаружены в клетках растений Карлом Вильгельмом фон Нэгели в 1842 году. Их поведение в клетках животных (саламандра ) было описано Вальтером. Флемминг, открывший митоз, в 1882 году. Название было придумано другим немецким анатомом, фон Вальдейером в 1888 году.
Прошел следующий этап. после развития генетики в начале 20-х гг. столетие, когда стало понятно, что набор хромосом (кариотип ) является носителем генов. Левицкий, по-видимому, был первым, кто определил кариотип как фенотип появления соматических хромосом, в отличие от их генного содержимого. Изучение кариотипа человека заняло много лет, чтобы разрешить самый главный вопрос: сколько хромосом содержит нормальная диплоидная клетка человека? В 1912 году сообщалось о 47 хромосомах в сперматогониях и 48 в оогониях, заключая механизм XX/XO определения пола. Painter в 1922 г. не был уверен, было ли диплоидное число людей 46 или 48, сначала отдавая предпочтение 46. Позже он пересмотрел свое мнение с 46 на 48, и он правильно настаивал на том, что люди имеют XX / XY Система определения пола. Учитывая их методы, эти результаты были весьма примечательными. В научных книгах количество хромосом человека оставалось на уровне 48 более тридцати лет. Чтобы исправить эту ошибку, потребовались новые методы. Джо Хин Тжио, работающий в лаборатории Альберта Левана, был ответственным за поиск подхода:
Только в 1956 году стало общепризнанным, что кариотип человека включал только 46 хромосомы. человекообразные обезьяны имеют 48 хромосом. Человеческая хромосома 2 была образована в результате слияния наследственных хромосом, в результате чего их количество уменьшилось.
Барбара МакКлинток ее карьера цитогенетика кукурузы. В 1931 году МакКлинток и Харриет Крейтон продемонстрировали, что цитологическая рекомбинация меченых хромосом коррелирует с рекомбинацией генетических признаков (генов ). МакКлинток, работая в Институте Карнеги, продолжил предыдущие исследования механизмов разрушения хромосом и слияния кукурузы. Она определила конкретное событие разрыва хромосомы, которое всегда происходило в одном и том же локусе на хромосоме 9 кукурузы, которую она назвала локусом «Ds» или «диссоциация». МакКлинток продолжила свою карьеру в цитогенетике, изучая механику и наследование сломанных и кольцевых (кольцевых) хромосом кукурузы. Во время своей цитогенетической работы МакКлинток обнаружила транспозоны, открытие, которое в конечном итоге привело к ее Нобелевской премии в 1983 году.
в 1930-е годы Добжанский и его сотрудники собрали Drosophila pseudoobscura из диких популяций в Калифорнии и соседних штатах. Используя технику Пейнтера, они изучили политенные хромосомы и обнаружили, что дикие популяции полиморфны для хромосомных инверсий. Все мухи похожи друг на друга, какие бы инверсии они ни несли: это пример загадочного полиморфизма.
Свидетельства быстро накапливались, чтобы показать, что естественный отбор виноват. Используя метод, изобретенный L'Héritier и Teissier, Добжанский разводил популяции в клетках для популяций, что позволяло кормить, разводить и собирать образцы, предотвращая побег. Это позволило исключить миграцию как возможное объяснение результатов. Запасы, содержащие инверсии с известной начальной частотой, могут поддерживаться в контролируемых условиях. Было обнаружено, что различные типы хромосом не колеблются случайным образом, как если бы они были избирательно нейтральными, а приспосабливались к определенным частотам, на которых они стабилизировались. К тому времени, когда Добжанский опубликовал третье издание своей книги в 1951 году, он был убежден, что хромосомные морфы поддерживаются в популяции за счет избирательного преимущества гетерозигот, как и в случае большинства полиморфизмов.
Лилия является предпочтительным организмом для цитологического исследования мейоза, поскольку хромосомы большие, и каждая морфологическая стадия мейоза может быть легко идентифицирована микроскопически. Хотта и др. представили доказательства общего паттерна синтеза ДНК и репарации в мужских мейотических клетках лилий и грызунов во время зиготен-пахитеновых стадий мейоза, когда предполагался кроссинговер. Наличие общего паттерна между такими филогенетически далекими организмами, как лилия и мышь, привело авт. К выводу, что организация мейотического кроссинговера, по крайней мере, у высших эукариот, вероятно, универсальна по распространению.
Филадельфийская транслокация t (9; 22) (q34; q11.2), наблюдаемая при хроническом миелолейкозе. После появления процедур, которые позволили легко подсчитывать хромосомы, были быстро сделаны открытия, связанные с аберрантными хромосомами или числом хромосом. При некоторых врожденных заболеваниях, таких как синдром Дауна, цитогенетика выявила природу хромосомного дефекта: «простая» трисомия. Аномалии, возникающие в результате событий нерасхождения, могут вызывать клетки с анеуплоидией (добавления или удаления целых хромосом) у одного из родителей или у плода. В 1959 году Лежен обнаружил, что пациенты с синдромом Дауна имеют дополнительную копию хромосомы 21. Синдром Дауна также называют трисомией 21.
Другие обнаруженные числовые аномалии включают аномалии половых хромосом. Женщина с только одной Х-хромосомой имеет синдром Тернера, тогда как дополнительная Х-хромосома у мужчины, в результате чего всего 47 хромосом, имеет синдром Клайнфельтера. Многие другие комбинации половых хромосом совместимы с живорождением, включая XXX, XYY и XXXX. Способность млекопитающих переносить анеуплоидии в половых хромосомах возникает из-за способности инактивировать их, что требуется у нормальных самок для компенсации наличия двух копий хромосомы. Не все гены на Х-хромосоме инактивированы, поэтому у людей с лишними Х-хромосомами наблюдается фенотипический эффект.
Трисомия 13 была связана с синдромом Патау, а трисомия 18 - с синдромом Эдвардса.
В 1960 году Питер Новелл и Дэвид Хангерфорд обнаружили небольшую хромосому в белых кровяных тельцах пациентов. с Хронический миелолейкоз (ХМЛ). Эта аномальная хромосома была названа Филадельфийской хромосомой - поскольку оба ученых проводили свои исследования в Филадельфии, Пенсильвания. Тринадцать лет спустя, с развитием более совершенных методов, Джанет Роули показала, что аномальная хромосома является результатом транслокации хромосом 9 и 22. Идентификация филадельфийской хромосомы по цитогенетике является диагностическим средством для ХМЛ.
Мужской кариотип человека. В конце 1960-х годов Торбьорн Касперссон разработал технику флуоресцентного окрашивания хинакрином (Q-полосу), которая позволила выявить уникальные схемы полосатости для каждая пара хромосом. Это позволило различать пары хромосом одинакового размера с помощью четких горизонтальных полос. Теперь для выявления точек разрыва и составляющих хромосом, участвующих в хромосомных транслокациях, используются шаблоны полос. Делеции и инверсии в отдельной хромосоме также могут быть идентифицированы и описаны более точно с использованием стандартизированной номенклатуры группирования. G-полосатость (с использованием трипсина и окраски по Гимзе / Райту) была одновременно разработана в начале 1970-х годов и позволяет визуализировать структуру полос с помощью микроскопа с ярким полем.
Диаграммы, идентифицирующие хромосомы на основе структуры полос, известны как идиограммы. Эти карты стали основой как пренатальной, так и онкологической областей, чтобы быстро перенести цитогенетику в клиническую лабораторию, где кариотипирование позволило ученым искать хромосомные изменения. Были расширены методы, позволяющие культивировать свободные амниоциты, извлеченные из околоплодных вод, а также методы удлинения для всех типов культур, которые позволяют создавать полосы с более высоким разрешением.
В 1980-х годах были достигнуты успехи в молекулярной цитогенетике. В то время как зонды, меченные радиоизотопами, гибридизовали с ДНК с 1969 года, теперь было принято решение использовать флуоресцентно меченые зонды. Гибридизация их с препаратами хромосом с использованием существующих методов стала известна как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). Это изменение значительно расширило использование методов зондирования, поскольку зонды с флуоресцентной меткой более безопасны. Дальнейшие достижения в области микроманипуляции и исследования хромосом привели к технологии микродиссекции хромосом, с помощью которой аберрации в хромосомной структуре можно было выделить, клонировать и изучить еще более подробно.
Стандартный хромосомный анализ (Кариотипирование ) относится к анализу метафаз хромосом, которые были объединены с использованием трипсина, за которым следует Giemsa, Leishmanns или их смесь. Это создает уникальные полосы на хромосомах. Молекулярный механизм и причина этих паттернов неизвестны, хотя, вероятно, они связаны с временем репликации и упаковкой хроматина.
В цитогенетических лабораториях используется несколько методов разбивки хромосом. Хинакрин полосатость (Q-полосатость) была первым методом окрашивания, используемым для получения специфических полос. Для этого метода требуется флуоресцентный микроскоп, и он больше не используется так широко, как Giemsa бэнды (G-бэнды). Обратное полосатость, или R-полосатость, требует термической обработки и меняет обычный черно-белый узор, который наблюдается в G-полосах и Q-полосах. Этот метод особенно полезен для окрашивания дистальных концов хромосом. Другие методы окрашивания включают окрашивание С-полосами и ядрышко организующей области (окрашивание NOR). Эти последние методы специфически окрашивают определенные участки хромосомы. C-бэндинг окрашивает конститутивный гетерохроматин, который обычно находится рядом с центромерой, а окрашивание NOR выделяет сателлиты и стебли акроцентрических хромосом.
Бэндинг с высоким разрешением включает окрашивание хромосом в профаза или ранняя метафаза (прометафаза), прежде чем они достигнут максимальной конденсации. Поскольку хромосомы профазы и прометафазы более протяженные, чем хромосомы в метафазе, количество полос, наблюдаемых для всех хромосом, увеличивается с примерно 300 до 450 до целых 800. Это позволяет обнаруживать менее очевидные аномалии, которые обычно не наблюдаются при обычном бандажировании.
Клетки костного мозга, крови, амниотической жидкости, пуповинной крови, опухоли и тканей (включая кожу, пуповина, ворсинки хориона, печень и многие другие органы) могут быть культивированы с использованием стандартных методов культивирования клеток для увеличения их количества. Затем в культуру добавляют митотический ингибитор (колхицин, колцемид ). Это останавливает деление клеток при митозе, что позволяет увеличить выход митотических клеток для анализа. Затем клетки центрифугируют, среду и ингибитор митоза удаляют и заменяют гипотоническим раствором. Это вызывает набухание белых кровяных телец или фибробластов, так что хромосомы распространяются при добавлении на предметное стекло, а также лизируют эритроциты. После того, как клеткам дали посидеть в гипотоническом растворе, добавляют фиксатор Карнуа (3: 1 метанол к ледяной уксусной кислоте ). Это убивает клетки и укрепляет ядра оставшихся лейкоцитов. Клетки обычно фиксируются многократно, чтобы удалить остатки или оставшиеся эритроциты. Затем суспензию клеток наносят на предметные стекла. После выдержки предметных стекол в духовке или ожидания в течение нескольких дней они готовы для обвязки и анализа.
Анализ полосовых хромосом проводится под микроскопом клиническим лабораторным специалистом по цитогенетике (CLSp (CG)). Обычно анализируется 20 ячеек, чего достаточно, чтобы исключить мозаичность до приемлемого уровня. Результаты суммируются и передаются сертифицированному цитогенетику для рассмотрения и написания интерпретации с учетом предыдущей истории болезни пациента и других клинических данных. Затем результаты представлены в Международной системе цитогенетической номенклатуры человека 2009 (ISCN2009).
Интерфазные клетки, положительные по перегруппировке t (9; 22) Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) относится к использованию флуоресцентно меченого зонда для гибридизации с цитогенетическими клеточными препаратами.
В дополнение к стандартным препаратам FISH также может выполняться на:
Этот раздел относится к приготовлению стандартных цитогенетических препаратов
Предметное стекло выдерживают с использованием солевого раствора, обычно состоящего из 2X SSC (соль, цитрат натрия). Затем слайды обезвоживают в этаноле и добавляют смесь зондов. Затем образец ДНК и ДНК зонда совместно денатурируют с использованием нагретой пластины и дают возможность повторно отжигаться в течение по меньшей мере 4 часов. Затем предметные стекла промывают для удаления избытка несвязавшегося зонда и окрашивают 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI ) или иодидом пропидия.
Анализ образцов FISH проводится с помощью флуоресцентной микроскопии клиническим лабораторным специалистом по цитогенетике. В онкологии обычно оценивается большое количество интерфазных клеток, чтобы исключить остаточную болезнь низкого уровня, обычно подсчитывается и оценивается от 200 до 1000 клеток. При врожденных проблемах обычно оценивается 20 метафазных клеток.
Достижения теперь сосредоточены на молекулярной цитогенетике, включая автоматизированные системы для подсчета результатов стандартных препаратов FISH и методы виртуального кариотипирования, такие как сравнительные массивы геномной гибридизации, массивы CGH и однонуклеотидный полиморфизм.
