Войти
Пробирки с биологическими образцами помещаются в жидкий азот. 
Криогенно-консервированные образцы удаляются из жидкого азота Дьюара.Криоконсервация или криоконсервация - это процесс, в котором органеллы, клетки, ткани, внеклеточный матрикс, органы или любые другие биологические конструкции, чувствительные к повреждениям, вызванным нерегулируемой химической кинетикой, сохраняются при охлаждении до очень низких температур (обычно -80 ° C с использованием твердого диоксида углерода или -196 ° C с использованием жидкого азота ). При достаточно низких температурах любая ферментативная или химическая активность, которая может вызвать повреждение рассматриваемого биологического материала, эффективно прекращается. Методы криоконсервации стремятся достичь низких температур, не вызывая дополнительных повреждений, вызванных образованием кристаллов льда во время замораживания. Традиционная криоконсервация основана на покрытии замораживаемого материала классом молекул, называемым криопротекторами. Новые методы исследуются из-за присущей токсичности многим криопротекторам. Криоконсервация генетических ресурсов животных осуществляется с целью сохранения породы.
Водные медведи (Тихоходка ), микроскопические многоклеточные организмы, могут пережить замораживание, заменяя большую часть своей внутренней воды на сахар трегалозу, предотвращение его кристаллизации, которая в противном случае повреждает клеточные мембраны. Смеси растворенных веществ могут достигать аналогичных эффектов. Некоторые растворенные вещества, включая соли, обладают тем недостатком, что они могут быть токсичными при высоких концентрациях. Кроме водяного медведя, древесные лягушки могут переносить замерзание крови и других тканей. Мочевина накапливается в тканях при подготовке к перезимовке, а гликоген печени в больших количествах превращается в глюкозу в ответ на образование внутреннего льда. И мочевина, и глюкоза действуют как «криопротекторы», ограничивая количество образующегося льда и уменьшая осмотическое сжатие клеток. Лягушки могут пережить многие случаи замораживания / оттаивания зимой, если замерзает не более 65% всей воды в организме. Исследования, посвященные феномену «замерзания лягушек», были выполнены в основном канадским исследователем доктором Кеннетом Б. Стори.
Морозостойкость, при которой организмы переживают зиму, замораживая твердое тело и прекращая жизненные функции. известен у нескольких позвоночных: пять видов лягушек (Rana sylvatica, Pseudacris triseriata, Hyla crucifer, Hyla versicolor, Hyla chrysoscelis ), одна из саламандр (Salamandrella keyserlingii ), одна из змей (Thamnophis sirtalis ) и три черепахи (Chrysemys picta, Terrapene carolina, Terrapene ornata ). Щелкающие черепахи Chelydra serpentina и настенные ящерицы Podarcis muralis также выживают при номинальном замораживании, но не было установлено, что они способны к перезимованию. В случае Rana sylvatica одним криоконсервантом является обычная глюкоза, концентрация которой увеличивается примерно на 19 ммоль / л при медленном охлаждении лягушек.
Один из первых теоретиков криоконсервации был Джеймс Лавлок. В 1953 году он предположил, что повреждение эритроцитов во время замораживания было вызвано осмотическим стрессом, и что увеличение концентрации соли в дегидратирующей клетке может повредить их. В середине 1950-х он экспериментировал с криоконсервацией грызунов, определив, что хомяков можно заморозить, если 60% воды в мозгу кристаллизовать в лед без каких-либо побочных эффектов; другие органы оказались подвержены повреждению. Эта работа подтолкнула других ученых к попытке кратковременного замораживания крыс к 1955 году, которые были полностью активными через 4-7 дней после оживления.
Криоконсервация применялась к людям, начиная с 1954 года, когда в результате осеменения произошло три беременности. предварительно замороженной спермы. Сперма птицы была заморожена в 1957 году группой ученых из Великобритании под руководством Кристофера Полджа. В 1963 году Питер Мазур из Национальной лаборатории Окриджа в США продемонстрировал, что смертельного внутриклеточного замораживания можно избежать, если охлаждение будет достаточно медленным, чтобы позволить воде покинуть клетку во время постепенного замораживания внеклеточной жидкости. Эта скорость различается для клеток разного размера и водопроницаемости: типичная скорость охлаждения около 1 ° C / мин подходит для многих клеток млекопитающих после обработки криопротекторами, такими как глицерин или диметилсульфоксид, но эта скорость не является универсальным оптимумом.
Первым человеческим телом, замороженным в надежде на будущее возрождение, было тело Джеймса Бедфорда через несколько часов после его смерти от рака в 1967 году. Бедфорд - единственный крионик пациент, замороженный до 1974 года, сохранился до сих пор.
Предполагается, что хранение при очень низких температурах обеспечивает неопределенную долговечность клеток, хотя фактическую эффективную жизнь довольно сложно доказать. Исследователи, экспериментирующие с высушенными семенами, обнаружили заметную изменчивость их порчи, когда образцы хранились при разных температурах - даже. Температуры ниже точки стеклования (Tg) водных растворов полиола, около -136 ° C (137 K; -213 ° F), по-видимому, принимаются в качестве диапазон, в котором биологическая активность очень существенно снижается, и -196 ° C (77 K; -321 ° F), температура кипения жидкого азота, является предпочтительной температурой для хранения важных образцов. В то время как холодильники, морозильники и морозильники сверххолодной заморозки используются для многих предметов, обычно сверххолодный жидкий азот требуется для успешного сохранения более сложных биологических структур, чтобы фактически остановить всю биологическую активность.
Явления, которые могут вызвать повреждение клеток во время криоконсервации, в основном возникают на стадии замораживания и включают: эффекты раствора, образование внеклеточного льда, обезвоживание и внутриклеточное образование льда. Многие из этих эффектов можно уменьшить с помощью криопротекторов. После того, как консервированный материал замерзнет, он относительно безопасен от дальнейшего повреждения.
Основные методы предотвращения повреждений при криоконсервации - это хорошо зарекомендовавшая себя комбинация контролируемой скорости и медленного замораживания, а также новый процесс мгновенного замораживания, известный как витрификация.
Резервуар с жидким азотом, используемый для питания криогенного морозильника (для хранения лабораторных образцов при температуре около -150 ° C) Контролируемый- скорость и медленное замораживание, также известное как медленное программируемое замораживание (SPF), представляет собой набор хорошо зарекомендовавших себя техник, разработанных в начале 1970-х годов, которые позволили произвести замороженное рождение первого человеческого эмбриона Зои Лейланд в 1984 году. С тех пор машины которые замораживают биологические образцы с использованием программируемых последовательностей или контролируемых скоростей, которые используются во всем мире для биологии человека, животных и клеток - «замораживание» образца для лучшего сохранения его для последующего размораживания перед его замораживанием или криоконсервацией в жидкий азот. Такие машины используются для замораживания ооцитов, кожи, продуктов крови, эмбрионов, сперматозоидов, стволовых клеток и общего сохранения тканей в больницах, ветеринарных клиниках и исследовательских лабораториях по всему миру. Например, количество живорождений от замороженных эмбрионов «медленно замороженных» оценивается примерно в 300 000–400 000 или 20% от оценочных 3 миллионов рождений, рожденных в результате экстракорпорального оплодотворения (ЭКО ).
Смертельного внутриклеточного замораживания можно избежать, если охлаждение будет достаточно медленным, чтобы позволить воде покинуть клетку во время постепенного замораживания внеклеточной жидкости. Чтобы свести к минимуму рост внеклеточных кристаллов льда и перекристаллизацию, биоматериалы, такие как альгинаты, поливиниловый спирт или хитозан могут быть использованы для предотвращения рост кристаллов льда вместе с традиционными низкомолекулярными криопротекторами. Эта скорость различается для клеток разного размера и водопроницаемости : типичная скорость охлаждения около 1 ° C / мин подходит для многих клеток млекопитающих после обработки криопротекторами, такими как глицерин или диметилсульфоксид, но скорость не является универсальным оптимумом. Скорость 1 ° C / мин может быть достигнута с помощью таких устройств, как морозильная камера с регулируемой скоростью или настольный портативный морозильный контейнер.
Несколько независимых исследований предоставили доказательства того, что замороженные эмбрионы, хранящиеся с использованием методов медленного замораживания, могут в некоторых случаях быть «лучше» свежего при ЭКО. Исследования показывают, что использование замороженных эмбрионов и яиц вместо свежих эмбрионов и яиц снижает риск мертворождения и преждевременных родов, хотя точные причины все еще изучаются.
Исследователи Грег Фэйи и Уильям Ф. Ралл помогли внедрить витрификацию в криоконсервацию репродуктивной системы в середине 1980-х годов. По состоянию на 2000 год исследователи утверждают, что стеклование обеспечивает преимущества криоконсервации без повреждений из-за образования кристаллов льда. Ситуация усложнилась с развитием тканевой инженерии, поскольку клетки и биоматериалы должны оставаться незамерзающими, чтобы сохранить высокую жизнеспособность и функции клеток, целостность конструкций и структуру биоматериалов. О витрификации тканеинженерных конструкций впервые сообщила Лилия Кулешова, которая также была первым ученым, добившимся витрификации ооцитов, что привело к рождению живого ребенка в 1999 году. Для клинической криоконсервации витрификация обычно требует добавления криопротекторы перед охлаждением. Криопротекторы - это макромолекулы, добавляемые в замораживающую среду для защиты клеток от пагубного воздействия образования внутриклеточных кристаллов льда или от воздействия раствора во время процесса замораживания и оттаивания. Они позволяют повысить выживаемость клеток во время замораживания, снизить температуру замерзания и защитить клеточную мембрану от повреждений, связанных с замораживанием. Криопротекторы обладают высокой растворимостью, низкой токсичностью при высоких концентрациях, низкой молекулярной массой и способностью взаимодействовать с водой через водородные связи.
Вместо кристаллизации сиропообразный раствор становится аморфным льдом - он остекленяет. В отличие от фазового перехода из жидкости в твердое тело в результате кристаллизации, аморфное состояние похоже на «твердую жидкость», и превращение происходит в небольшом температурном диапазоне, описываемом как температура «стеклования ».
Стеклованию воды способствует быстрое охлаждение и может быть достигнуто без криопротекторов путем чрезвычайно быстрого снижения температуры (мегакельвинов в секунду). Скорость, необходимая для достижения стекловидного состояния в чистой воде, считалась невозможной до 2005 года.
Для стеклования обычно требуются два условия: повышение вязкости и снижение температуры замерзания. Многие растворенные вещества обладают и тем, и другим, но более крупные молекулы обычно оказывают большее влияние, особенно на вязкость. Быстрое охлаждение также способствует витрификации.
Согласно общепринятым методам криоконсервации растворенное вещество должно проникать через клеточную мембрану для достижения повышенной вязкости и снижения температуры замерзания внутри клетки. Сахара не проникают через мембрану. Те растворенные вещества, которые это делают, такие как диметилсульфоксид, обычный криопротектор, часто являются токсичными в высокой концентрации. Один из сложных компромиссов остекловывания криоконсервации касается ограничения ущерба, наносимого самим криопротектором из-за токсичности криопротектора. Смеси криопротекторов и блокаторы льда позволили компании Twenty-First Century Medicine витрифицировать почку кролика до -135 ° C с их запатентованной витрификацией. смесь. После согревания почка была успешно трансплантирована кролику с полной функциональностью и жизнеспособностью, способной поддерживать кролика в качестве единственной функционирующей почки на неопределенный срок.
Кровь можно заменить инертной благородные газы и / или метаболически важные газы, такие как кислород, так что органы могут охлаждаться быстрее, и требуется меньше антифриза. Поскольку участки ткани разделены газом, небольшие расширения не накапливаются, что защищает их от разрушения. Небольшая компания Arigos Biomedical «уже вылечила свиньи сердца после 120 градусов ниже нуля», хотя определение термина «выздоровевшие» не совсем понятно. Давление 60 атм может помочь увеличить скорость теплообмена. Перфузия / персуффляция газообразным кислородом может улучшить сохранность органов по сравнению со статическим хранением в холодильнике или перфузией с помощью гипотермической машины, поскольку более низкая вязкость газов может помочь достичь большего количества областей сохраненных органов и доставить больше кислорода на грамм ткани.
Как правило, криоконсервацию легче проводить для тонких образцов и взвешенных клеток, потому что они могут охлаждаться быстрее, и поэтому требуются меньшие дозы токсичных криопротекторов. Следовательно, криоконсервация печени и сердца человека для хранения и трансплантации по-прежнему нецелесообразна.
Тем не менее, подходящие комбинации криопротекторов и режимов охлаждения и полоскания во время нагревания часто позволяют успешно криоконсервировать биологические материалы, особенно суспензии клеток или образцы тонких тканей. Примеры включают:
Кроме того, прилагаются усилия ведутся работы по криогенному сохранению людей, известные как крионика. При таких усилиях либо мозг в голове, либо все тело может испытать вышеуказанный процесс. Однако крионика относится к другой категории, нежели вышеупомянутые примеры: в то время как бесчисленные криоконсервированные клетки, вакцины, ткани и другие биологические образцы были разморожены и успешно использованы, это еще не относится к криоконсервированным мозгам или телам. Речь идет о критериях определения «успеха».
Сторонники крионики утверждают, что криоконсервация с использованием современных технологий, в частности витрификации мозга, может быть достаточной для сохранения людей в "теоретическом смысле ", чтобы их можно было оживить и сделать здоровыми. гипотетическими технологиями будущего.
Прямо сейчас ученые пытаются понять, жизнеспособна ли трансплантация криоконсервированных человеческих органов для трансплантации, если так, то это будет большим шагом вперед для возможности оживления криоконсервированного человека.
Криоконсервация эмбрионов используется для хранения эмбрионов, например, когда оплодотворение in vitro (ЭКО) привело к появлению большего количества эмбрионов, чем необходимо в настоящее время.
Сообщалось о беременностях от эмбрионов, хранившихся 16 лет. Многие исследования оценивали детей, рожденных от замороженных эмбрионов, или «заморозков». Результат был неизменно положительным без увеличения врожденных дефектов или аномалий развития. Исследование более 11000 криоконсервированных человеческих эмбрионов не показало значительного влияния времени хранения на выживаемость после оттаивания для циклов ЭКО или донорства ооцитов, а также для эмбрионов, замороженных на стадии пронуклеуса или дробления. Кроме того, продолжительность хранения не оказала существенного влияния на клиническую беременность, выкидыш, имплантацию или частоту живорождений, будь то в результате циклов ЭКО или донорства ооцитов. Скорее, возраст ооцитов, процент выживаемости и количество перенесенных эмбрионов являются предикторами исхода беременности.
Криоконсервация ткани яичника представляет интерес для женщин, которые хотят сохранить свою репродуктивную функцию сверх естественный предел, или репродуктивному потенциалу которого угрожает терапия рака, например, при гематологических злокачественных новообразованиях или раке груди. Процедура заключается в том, чтобы взять часть яичника и произвести медленное замораживание, прежде чем помещать его в жидкий азот на время терапии. Затем ткань может быть разморожена и имплантирована рядом с маточным участком, либо ортотопической (в естественном месте), либо гетеротопической (на брюшной стенке), где она начинает производить новые яйца, обеспечивая нормальное зачатие. Ткань яичника также может быть трансплантирована мышам с ослабленным иммунитетом (мыши SCID ), чтобы избежать отторжения трансплантата, а ткань можно собирать позже, когда разовьются зрелые фолликулы.
Криоконсервация человеческих ооцитов - это новая технология, при которой женские яйца (ооциты ) извлекаются, замораживаются и хранятся. Позже, когда она будет готова забеременеть, яйца можно разморозить, оплодотворить и перенести в матку в виде эмбрионов. С 1999 года, когда Кулешова и ее сотрудники сообщили о рождении первого ребенка от эмбриона, полученного из застеклованных, нагретых женских яиц, в журнале Human Reproduction, эта концепция получила признание и широкое распространение. Этот прорыв в достижении витрификации ооцитов женщины сделал важный шаг вперед в наших знаниях и практике процесса ЭКО, поскольку частота клинической беременности после витрификации ооцитов в четыре раза выше, чем после медленного замораживания. Витрификация ооцитов жизненно важна для сохранения фертильности у молодых онкологических пациентов и для людей, подвергающихся ЭКО, которые по религиозным или этическим причинам возражают против практики замораживания эмбрионов.
Сперма после криоконсервации может успешно использоваться почти неограниченное время. Самый длинный зарегистрированный успешный срок хранения - 22 года. Его можно использовать для донорства спермы, когда реципиент хочет получить лечение в другое время или в другом месте, или как средство сохранения фертильности для мужчин, подвергающихся вазэктомии или лечения, которое может поставить под угрозу их фертильность., например химиотерапия, лучевая терапия или хирургическое вмешательство.
Криоконсервация незрелой тестикулярной ткани - это развивающийся метод, помогающий репродуктивным функциям мальчиков, которым требуется гонадотоксическая терапия. Данные на животных являются многообещающими, поскольку здоровое потомство было получено после трансплантации замороженных суспензий клеток яичка или кусочков ткани. Однако ни один из вариантов восстановления фертильности из замороженной ткани, то есть трансплантации клеточной суспензии, трансплантации ткани и созревания in vitro (IVM), пока не доказал свою эффективность и безопасность для людей.
Четыре различных экотипа Physcomitrella patens, хранящиеся в IMSC.Криоконсервация целых растений мха , особенно Physcomitrella patens, был разработан Ральфом Рески и сотрудниками и проводится в International Moss Stock Center. Этот биобанк собирает, сохраняет и распределяет мух мутанты и экотипы мха .
МСК при немедленном переливании внутри Через несколько часов после оттаивания может проявляться пониженная функция или сниженная эффективность при лечении заболеваний по сравнению с теми МСК, которые находятся в логарифмической фазе роста клеток (свежие). В результате криоконсервированные МСК должны быть возвращены в логарифмическую фазу роста клеток в культуре in vitro, прежде чем они будут введены для клинических испытаний или экспериментального лечения. Повторное культивирование МСК поможет оправиться от шока, который клетки получают при замораживании и оттаивании. Различные клинические испытания МСК, в которых использовались криоконсервированные продукты сразу после оттаивания, не увенчались успехом, по сравнению с теми клиническими испытаниями, в которых использовались свежие МСК.
Бактерии и грибы можно сократить- срок (от месяцев до года, в зависимости от) в холодильнике, однако деление клеток и метаболизм не прекращаются полностью и, таким образом, не являются оптимальным вариантом для длительного хранения (годы) или сохранения культур генетически или фенотипически, поскольку деление клеток может привести к мутации или субкультивирование может вызвать фенотипические изменения. Предпочтительным вариантом, зависящим от вида, является криоконсервация. Нематодные черви - единственные многоклеточные эукариоты, которые выживают при криоконсервации. Шатилович А.В., Чесунов А.В., Неретина Т.В., Грабарник И.П., Губин С.В., Вишнивецкая Т.А., Онстотт Т.С., Ривкина Е.М. (май 2018). «Жизнеспособные нематоды из позднеплейстоценовой вечной мерзлоты Колымской низменности». Доклады биологических наук: Известия АН СССР, разделы биологических наук. 480 (1): 100–102. doi : 10.1134 / S0012496618030079. PMID 30009350. S2CID 49743808.
Грибы, особенно зигомицеты, аскомицеты и высшие базидиомицеты, независимо от споруляции, могут храниться в жидком азоте или в условиях глубокой заморозки. Криоконсервация - отличительный метод для грибов, которые не образуют споры (в противном случае можно использовать другие методы консервации спор с меньшими затратами и легкостью), спорулят, но имеют нежные споры (большие или чувствительные к замораживанию), являются патогенными (опасны для сохранения метаболической активности гриб) или должны использоваться для генетических запасов (в идеале, чтобы иметь такой же состав, как и исходный депозит). Как и для многих других организмов, используются криопротекторы, такие как ДМСО или глицерин (например, 10% глицерина нитчатых грибов или 20% глицерина дрожжей). Различия между выбором криопротекторов зависят от вида (или класса), но обычно для грибков наиболее эффективны проникающие криопротекторы, такие как ДМСО, глицерин или полиэтиленгликоль (другие непроникающие вещества включают сахара, маннит, сорбит, декстран и т. Д.). Повторение замораживания-оттаивания не рекомендуется, так как это может снизить жизнеспособность. Рекомендуются резервные морозильные камеры или места для хранения жидкого азота. Ниже приводится краткое изложение нескольких протоколов замораживания (в каждом используются полипропиленовые криопробирки с завинчивающейся крышкой):
Многие распространенные культивируемые лабораторные штаммы подвергаются глубокой заморозке для сохранения генетически и фенотипически стабильных долгосрочных запасов.. Субкультивирование и длительное хранение образцов в холодильнике может привести к потере плазмиды (ей) или мутациям. Общие конечные процентные содержания глицерина составляют 15, 20 и 25. Из чашки со свежей культурой выбирают одну интересующую колонию и готовят жидкую культуру. Из жидкой культуры среду непосредственно смешивают с равным количеством глицерина; колонию следует проверить на наличие каких-либо дефектов, таких как мутации. Перед длительным хранением все антибиотики необходимо вымыть из культуры. Способы различаются, но перемешивание может осуществляться осторожно путем переворачивания или быстро путем завихрения, а охлаждение может варьироваться путем помещения криопробирки непосредственно при температуре от -50 до -95 ° C, шоковой заморозки в жидком азоте или постепенного охлаждения, а затем хранения при -80 ° C или охладитель (жидкий азот или пар жидкого азота). Извлечение бактерий также может варьироваться, а именно, если гранулы хранятся внутри пробирки, тогда несколько шариков можно использовать для тарелки, или замороженную массу можно соскоблить с помощью петли, а затем высеять, однако, поскольку требуется лишь небольшой запас, вся пробирка должна никогда не размораживать полностью, и следует избегать повторного замораживания-размораживания. 100% восстановление невозможно независимо от методологии.
Микроскопические почвенные обитатели нематода круглые черви Panagrolaimus detritophagus и Plectus parvus - единственные эукариотические организмы, жизнеспособность которых на сегодняшний день доказана после длительного криоконсервации. В данном случае сохранение было естественным, а не искусственным из-за вечной мерзлоты.
