Сравнительная геномная гибридизация

редактировать

Сравнительная геномная гибридизация (CGH) - это молекулярный цитогенетический метод для анализа вариаций числа копий (CNV) относительно уровня плоидности в ДНК тестового образца по сравнению с эталонным образцом без необходимости культивирования клеток. Целью этого метода является быстрое и эффективное сравнение двух образцов геномной ДНК, полученных из двух источников, которые чаще всего тесно связаны, поскольку есть подозрение, что они содержат различия с точки зрения увеличения или уменьшения целых хромосом или субхромосомные области (часть целой хромосомы). Этот метод был первоначально разработан для оценки различий между хромосомными элементами солидной опухоли и нормальной ткани и имеет улучшенное разрешение на 5–10 мегабаз по сравнению с более традиционными методами цитогенетического анализа Гимза-бэнды и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), которые ограничены разрешением используемого микроскопа.

Это достигается за счет использования конкурентной флуоресценции гибридизации in situ. Короче говоря, это включает выделение ДНК из двух сравниваемых источников, чаще всего тестового и эталонного, независимую маркировку каждого образца ДНК с помощью флуорофоров (флуоресцентных молекул) разные цвета (обычно красный и зеленый), денатурация ДНК, так что она является одноцепочечной, и гибридизация двух полученных образцов в соотношении 1: 1 к нормальному метафаза распространение хромосом, с которыми меченые образцы ДНК будут связываться в их локусе происхождения. Затем с помощью флуоресцентного микроскопа и компьютерного программного обеспечения различные флуоресцентные сигналы сравниваются по длине каждой хромосомы для идентификации хромосомных различий между двумя источниками. Более высокая интенсивность цвета тестового образца в определенной области хромосомы указывает на увеличение материала этой области в соответствующем исходном образце, в то время как более высокая интенсивность цвета эталонного образца указывает на потерю материала в тестовом образце в этом конкретном образце. область. Нейтральный цвет (желтый, когда метки флуорофоров красный и зеленый) указывает на отсутствие разницы между двумя образцами в этом месте.

CGH способен обнаруживать только несбалансированные хромосомные аномалии. Это связано с тем, что сбалансированные хромосомные аномалии, такие как реципрокные транслокации, инверсии или кольцевые хромосомы, не влияют на количество копий, что и обнаруживается технологиями CGH. Однако CGH позволяет исследовать все 46 хромосом человека в одном тесте и обнаруживать делеции и дупликации даже в микроскопическом масштабе, что может привести к идентификации генов-кандидатов, которые будут дополнительно изучены другие цитологические методы.

Благодаря использованию ДНК-микрочипов в сочетании с методами CGH, была разработана более специфическая форма массива CGH (aCGH), позволяющая локус за локусом измерение CNV с повышенным разрешением до 100 килобаз. Этот усовершенствованный метод позволяет выявить этиологию известных и неизвестных состояний.

Содержание

  • 1 История
  • 2 Основные методы
    • 2.1 Подготовка слайдов в метафазах
    • 2.2 Выделение ДНК из тестируемой ткани и эталонной ткани
    • 2.3 Мечение ДНК
    • 2.4 Блокирование
    • 2.5 Гибридизация
    • 2.6 Визуализация флуоресценции и визуализация
    • 2.7 Дополнительные примечания
  • 3 Сравнительная геномная гибридизация массивов
    • 3.1 Методология
    • 3.2 Технологические подходы к массиву CGH
    • 3.3 Подходы к проектированию
  • 4 Приложения
    • 4.1 Обычные
      • 4.1.1 В исследованиях рака
      • 4.1.2 Хромосомные аберрации
    • 4.2 CGH массива
      • 4.2.1 Геномные аномалии при раке
      • 4.2.2 Субмикроскопические аберрации
      • 4.2.3 Пренатальная генетическая диагностика
  • 5 Ограничения CGH и массив CGH
  • 6 См. Также
  • 7 Ссылки
  • 8 Внешние ссылки

История

Мотивация, лежащая в основе развития CGH, проистекает из тот факт, что доступные формы цитогенетического анализа в то время (полосатость Гимзы и FISH ) были ограничены в их потенциальном разрешении с помощью микроскопов необходимо для интерпретации предоставленных ими результатов. Кроме того, интерпретация полос Гимзы потенциально может быть неоднозначной и поэтому снижает надежность, и оба метода требуют больших трудозатрат, что ограничивает локусы, которые можно исследовать.

Первый отчет об анализе CGH был сделан Каллиониеми и его коллегами в 1992 году из Калифорнийского университета в Сан-Франциско, которые использовали CGH для анализа солидных опухолей. Они достигли этого путем прямого применения метода как к клеточным линиям рака груди, так и к первичным опухолям мочевого пузыря, чтобы установить полное количество копий кариотипов для клеток. Им удалось идентифицировать 16 различных областей амплификации, многие из которых были новыми открытиями.

Вскоре после этого, в 1993 году, du Manoir et al. сообщили практически о той же методологии. Авторы нарисовали серию отдельных человеческих хромосом из библиотеки ДНК с двумя разными флуорофорами в разных пропорциях, чтобы проверить методику, а также применили CGH к геномной ДНК пациентов, страдающих либо синдром Дауна или Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, а также клетки линии клеток почечной папиллярной карциномы. Был сделан вывод о том, что полученные соотношения флуоресценции были точными и что различия между геномной ДНК из разных типов клеток можно было обнаружить, и, следовательно, что CGH был очень полезным инструментом цитогенетического анализа.

Изначально технология CGH была широко распространена. трудно, поскольку протоколы не были единообразными, и поэтому возникали несоответствия, особенно из-за неопределенности в интерпретации данных. Однако в 1994 году был опубликован обзор, в котором подробно описывался легко понятный протокол, а программное обеспечение для анализа изображений стало коммерчески доступным, что позволило использовать CGH во всем мире. Поскольку новые методы, такие как микродиссекция и вырожденный олигонуклеотид примированный полимеразная цепная реакция (ДОФ-ПЦР), стали доступны для получения продуктов ДНК, появилась возможность применять концепция CGH для меньших хромосомных аномалий, и, таким образом, разрешение CGH было улучшено.

Реализация массива CGH, посредством которого ДНК-микрочипы используются вместо традиционной подготовки метафазных хромосом, была впервые был разработан Солинасом-Толодо и др. в 1997 г. с использованием опухолевых клеток и Pinkel et al. в 1998 году с использованием клеток рака груди. Это стало возможным благодаря Проекту генома человека, который создал библиотеку клонированных фрагментов ДНК с известными местоположениями по всему человеческому геному, причем эти фрагменты использовались в качестве зондов на микрочипе ДНК. Теперь зонды различного происхождения, такие как кДНК, продукты геномной ПЦР и бактериальные искусственные хромосомы (ВАС), могут использоваться на микрочипах ДНК, которые могут содержать до 2 миллионов зондов. Array CGH автоматизирован, обеспечивает большее разрешение (до 100 kb), чем традиционный CGH, поскольку зонды намного меньше, чем препараты метафазы, требуют меньшего количества ДНК, могут быть нацелены на определенные хромосомные области, если это необходимо, и упорядочены и, следовательно, быстрее анализируются, что делает его гораздо более адаптируемым для диагностических целей.

Рис. 1. Схема протокола CGH

Основные методы

Подготовка слайдов в метафазе

ДНК на слайде является эталонным образцом, и, таким образом, получен от кариотипически нормального мужчины или женщины, хотя предпочтительно использовать женскую ДНК, поскольку они обладают двумя X-хромосомами, которые содержат гораздо больше генетической информации, чем мужская Y-хромосома. Используются стимулированные фитогемагглютинином лимфоциты периферической крови. 1 мл гепаринизированной крови добавляют к 10 мл культуральной среды и инкубируют в течение 72 часов при 37 ° C в атмосфере 5% CO 2. Для остановки митоза клеток добавляют колхицин, затем клетки собирают и обрабатывают гипотоническим хлоридом калия и фиксируют в 3: 1 метаноле / уксусной кислоте.

Один Затем каплю суспензии клеток следует капнуть на очищенное этанолом предметное стекло с расстояния около 30 см, оптимально это следует проводить при комнатной температуре и уровне влажности 60–70%. Слайды следует оценивать путем визуализации с помощью фазово-контрастного микроскопа, следует наблюдать минимальную цитоплазму, хромосомы не должны перекрываться, иметь длину 400–550 полос без разделенных хроматид и, наконец, должны выглядеть темными, а не блестящими. Затем слайды необходимо сушить на воздухе в течение ночи при комнатной температуре, и любое дальнейшее хранение следует проводить группами по четыре при -20 ° C с присутствием гранул диоксида кремния или азота для поддержания сухости. Следует тестировать разных доноров, поскольку гибридизация может быть разной. Можно использовать имеющиеся в продаже слайды, но их всегда следует тестировать в первую очередь.

Выделение ДНК из тестируемой ткани и эталонной ткани

Стандартная экстракция фенолом используется для получения ДНК из тестовая или эталонная ткань (кариотипически нормальный индивидуум), которая включает комбинацию Трис - этилендиаминтетрауксусной кислоты и фенола с водной ДНК в равной степени суммы. За этим следует разделение путем перемешивания и центрифугирования, после чего водный слой удаляют и дополнительно обрабатывают с использованием эфира, и, наконец, осаждение этанолом используют для концентрирования ДНК..

Может быть выполнено с использованием имеющихся в продаже наборов для выделения ДНК, которые основаны на аффинных колонках.

Предпочтительно, ДНК следует экстрагировать из свежей или замороженной ткани, так как это будет самого высокого качества, хотя и Теперь можно использовать архивные материалы, содержащие фиксированный формалин или парафиновый воск, при условии соблюдения соответствующих процедур. 0,5-1 мкг ДНК достаточно для эксперимента CGH, хотя, если желаемое количество не получено, для амплификации ДНК может применяться ДОФ-ПЦР, однако в этом случае важно применять ДОФ-ПЦР как для теста, так и для эталонные образцы ДНК для повышения надежности.

Мечение ДНК

Ник-трансляция используется для мечения ДНК и включает разрезание ДНК и замену нуклеотидов, меченных флуорофором (прямое мечение) или биотином или оксигенином, чтобы получить флуофор конъюгированные антитела добавлены позже (непрямое мечение). Затем важно проверить длину фрагментов как тестируемой, так и эталонной ДНК с помощью гель-электрофореза, поскольку для оптимальной гибридизации они должны находиться в диапазоне от 500 до 1500 килобайт.

Блокирование

Немаркированная ДНК Cot-1 компании Life Technologies Corporation (плацентарная ДНК, обогащенная повторяющимися последовательностями длиной 50-100 пар оснований) добавляется для блокирования нормальных повторяющихся последовательностей ДНК, особенно в центромерах и теломерах, поскольку эти последовательности, если они обнаружены, могут снизить коэффициент флуоресценции и привести к тому, что прирост или потеря не будут обнаружены.

Гибридизация

8–12 мкл каждого из меченых тестируемых и меченых эталонных ДНК смешивают и 40 Добавляют мкг ДНК Cot-1, затем осаждают и затем растворяют в 6 мкл смеси для гибридизации, которая содержит 50% формамида для снижения температуры плавления ДНК и 10% сульфата декстрана для повышения эффективной концентрации зонда в физиологическом растворе цитрата натрия (SSC) при температуре pH 7,0.

Денатурация предметного стекла и d-зонды выполняются отдельно. Предметное стекло погружают в 70% формамид / 2xSSC на 5–10 минут при 72 ° C, в то время как зонды денатурируют путем погружения в водяную баню с температурой 80 ° C на 10 минут и немедленно добавляют к препарату метафазного предметного стекла. Затем на эту реакционную смесь накрывают покровное стекло и оставляют на два-четыре дня во влажной камере при 40 ° C.

Затем покровное стекло удаляют и промывают 5 минут, три раза с использованием 2xSSC при комнатной температуре, один при 45 ° C с 0,1xSSC и один с использованием TNT при комнатной температуре. Затем реакционную смесь предварительно инкубируют в течение 10 минут, затем следует 60-минутная инкубация при 37 ° C, еще три промывания по 5 минут TNT, затем одна промывка 2xSSC при комнатной температуре. Затем предметное стекло сушат, используя серию этанола 70% / 96% / 100% перед контрастным окрашиванием DAPI (0,35 мкг / мл) для идентификации хромосом и запечатывания покровным стеклом.

Визуализация и визуализация флуоресценции

A флуоресцентный микроскоп с соответствующими фильтрами для окрашивания DAPI, а также с двумя используемыми флуорофорами необходим для визуализации, и эти фильтры также должны минимизировать перекрестные помехи между флуорофорами, такие как узкая полоса пропускания фильтры. Микроскоп должен обеспечивать равномерное освещение без хроматических вариаций, быть правильно выровненным и иметь объектив типа «план», который является апохроматическим и дает увеличение x63 или x100.

Изображение должно быть записано с помощью камеры с пространственным разрешением не менее 0,1 мкм на уровне образца и давать изображение размером не менее 600x600 пикселей. Камера также должна быть способна интегрировать изображение в течение как минимум 5-10 секунд с минимальным фотометрическим разрешением 8 бит.

Специальное программное обеспечение CGH коммерчески доступно для этапа обработки изображения и требуется для вычитания фоновый шум, удаление и сегментирование материалов не хромосомного происхождения, нормализация коэффициента флуоресценции, выполнение интерактивного кариотипирования и масштабирования хромосом до стандартной длины. «Кариотип с относительным числом копий», который представляет хромосомные области делеций или амплификаций, генерируется путем усреднения соотношений ряда высококачественных метафаз и построения их на идеограмме, диаграмме, идентифицирующей хромосомы на основе структуры полос. Интерпретация профилей соотношения проводится либо с использованием фиксированных, либо статистических пороговых значений (доверительные интервалы ). При использовании доверительных интервалов выигрыш или потеря определяются, когда 95% коэффициента флуоресценции не содержит 1,0.

Дополнительные примечания

Необходимо проявлять особую осторожность, чтобы избежать загрязнения любого этапа, связанного с ДНК, особенно с тестовой ДНК, поскольку загрязнение образца нормальной ДНК приведет к искажению результатов ближе к 1,0, таким образом, отклонения могут остаться незамеченными. Для подтверждения результатов можно использовать эксперименты FISH, ПЦР и проточной цитометрии.

Сравнительная геномная гибридизация на основе массивов

Сравнительная геномная гибридизация на основе микрочипов (также микроматрица- на основе сравнительной геномной гибридизации, матрицы CGH, массива CGH, aCGH) представляет собой молекулярный цитогенетический метод обнаружения хромосомных изменений числа копий в масштабе всего генома и с высоким разрешением. Array CGH сравнивает геном пациента с эталонным геномом и выявляет различия между двумя геномами и, следовательно, определяет местонахождение областей геномного дисбаланса у пациента, используя те же принципы конкурентной флуоресценции in situ гибридизации, что и традиционные CGH.

С введением массива CGH преодолевается главное ограничение обычного CGH - низкое разрешение. В массиве CGH метафазные хромосомы заменены клонированными фрагментами ДНК (+ 100–200 т.п.н.), точное хромосомное положение которых известно. Это позволяет более подробно обнаруживать аберрации и, кроме того, позволяет отображать изменения непосредственно на геномной последовательности.

Массив CGH оказался специфичным, чувствительным, быстрым и высокопроизводительный метод со значительными преимуществами по сравнению с другими методами, используемыми для анализа изменений количества копий ДНК, что делает его более удобным для диагностических приложений. Используя этот метод, можно обнаружить количество копий изменений на уровне 5–10 килобаз последовательностей ДНК. По состоянию на 2006 год массивы even () являются точными для обнаружения структурных изменений (SV) при разрешении 200 пар оснований. Этот метод позволяет идентифицировать новые повторяющиеся хромосомные изменения, такие как микроделеции и дупликации в человеческих условиях, таких как рак и врожденные дефекты, из-за хромосомных аберраций.

Рисунок 2. Протокол Array-CGH

Методология

Array CGH основан на том же принципе, что и традиционный CGH. В обоих методах ДНК из эталонного (или контрольного) образца и ДНК из тестируемого (или пациента) образца по-разному помечаются двумя разными флуорофорами и используются в качестве зондов, которые конкурентно гибридизуются на нуклеиновой кислоте. целей. В обычном CGH целью является эталонный метафазный разброс. В массиве CGH этими мишенями могут быть фрагменты генома, клонированные в различных векторах (таких как ВАС или плазмиды ), кДНК или олигонуклеотиды.

Рисунок 2. представляет собой схематический обзор метода массива CGH. ДНК из исследуемого образца помечается красным флуорофором (Цианин 5), а эталонный образец ДНК метится зеленым флуорофором (Цианин 3). Равные количества двух образцов ДНК смешивают и совместно гибридизируют с получением микрочипа ДНК из нескольких тысяч равномерно расположенных клонированных фрагментов ДНК или олигонуклеотидов, которые были нанесены на матрицу в трех экземплярах. После гибридизации системы цифрового изображения используются для захвата и количественной оценки относительной интенсивности флуоресценции каждого из гибридизированных флуорофоров. Результирующее соотношение интенсивностей флуоресценции пропорционально отношению количества копий последовательностей ДНК в тестовом и эталонном геномах. Если интенсивности флурохромов равны на одном зонде, эта область генома пациента интерпретируется как имеющая одинаковое количество ДНК в исследуемом и контрольном образцах; если есть измененное соотношение Cy3: Cy5, это указывает на потерю или усиление ДНК пациента в этой конкретной области генома.

Технологические подходы к массиву CGH

Профиль ACGH линии клеток нейробластомы IMR32

Array CGH был реализован с использованием самых разных методов. Следовательно, некоторые преимущества и ограничения массива CGH зависят от выбранной техники. Первоначальные подходы использовали массивы, полученные из больших вставок клонов геномной ДНК, таких как ВАС. Использование BAC обеспечивает достаточно интенсивные сигналы для обнаружения единичных изменений и точного определения границ аберраций. Однако исходные выходы ДНК изолированных клонов ВАС низкие, и необходимы методы амплификации ДНК. Эти методы включают лигирование -опосредованную полимеразной цепной реакцией (ПЦР), ПЦР с вырожденными праймерами с использованием одного или нескольких наборов праймеров и амплификацию по типу катящегося круга. Массивы также могут быть построены с использованием кДНК. Эти массивы в настоящее время обеспечивают высокое пространственное разрешение, но количество кДНК ограничено генами, которые кодируются на хромосомах, и их чувствительность низкая из-за перекрестной гибридизации. Это приводит к невозможности обнаружения изменений единственной копии в масштабе всего генома. Последний подход заключается в обнаружении массивов с короткими олигонуклеотидами. Количество олигонуклеотидов практически бесконечно, а обработка выполняется быстро, экономично и легко. Хотя олигонуклеотиды не обладают чувствительностью для обнаружения изменений единичных копий, усреднение соотношений из олигонуклеотидов, которые отображаются рядом друг с другом на хромосоме, может компенсировать пониженную чувствительность. Также можно использовать массивы с перекрывающимися зондами, чтобы можно было обнаружить определенные точки останова.

Подходы к дизайну

Существует два подхода к созданию микрочипов для приложений CGH: полногеномный и таргетированный.

Массивы полного генома предназначены для покрытия всего генома человека. Они часто включают клоны, которые обеспечивают широкий охват генома; и массивы, которые имеют непрерывное покрытие в пределах генома. Полногеномные массивы были созданы в основном для исследовательских целей и доказали свою выдающуюся ценность в открытии генов. Они также очень ценны при скрининге генома на предмет прироста и потери ДНК с беспрецедентным разрешением.

Целевые массивы разработаны для определенной области (областей) генома с целью оценки этого целевого сегмента. Он может быть разработан для изучения конкретной хромосомы или хромосомного сегмента или для выявления и оценки конкретных отклонений дозировки ДНК у лиц с подозрением на синдромы микроделеции или субтеломерные перестройки. Важнейшая цель целевого микрочипа в медицинской практике - предоставить клинически полезные результаты для диагностики, генетического консультирования, прогноза и клинического лечения несбалансированных цитогенетических аномалий.

Применения

Обычные

Обычный CGH использовался в основном для идентификации хромосомных областей, которые периодически теряются или приобретаются в опухолях, а также для диагностики и прогноза рака. Этот подход также может быть использован для изучения хромосомных аберраций в фетальных и неонатальных геномах. Кроме того, обычный CGH можно использовать для выявления хромосомных аномалий, и было показано, что он эффективен при диагностике сложных аномалий, связанных с генетическими нарушениями человека.

В исследованиях рака

Данные CGH из нескольких исследований опухоли одного и того же типа демонстрируют закономерности неслучайных генетических аберраций. Некоторые из этих изменений, по-видимому, являются общими для различных видов злокачественных опухолей, в то время как другие более специфичны для опухоли. Например, прирост хромосомных участков lq, 3q и 8q, а также потеря 8p, 13q, 16q и 17p являются общими для ряда типов опухолей, таких как рак груди, яичников, простаты, почек и мочевого пузыря (рис. 3). Другие изменения, такие как прирост 12p и Xp при раке яичка, прирост 13q потеря 9q при раке мочевого пузыря, потеря 14q при раке почек и потеря Xp при раке яичников более специфичны и могут отражать уникальные силы отбора, действующие во время развития рака в различных органах.. Array CGH также часто используется в исследованиях и диагностике В-клеточных злокачественных новообразований, таких как хронический лимфолейкоз.

Хромосомные аберрации

Cri du Chat (CdC) - это синдром, вызванный частичной делецией короткого плеча хромосомы 5. Несколько исследований показали, что обычный CGH подходит для обнаружения делеции, а также более сложные хромосомные изменения. Например, Леви и др. (2002) сообщили о младенце с кошачьим криком, отличительным признаком CdC, но с нечетким кариотипом. CGH-анализ выявил потерю хромосомного материала из 5p15.3, что подтвердило диагноз клинически. Эти результаты демонстрируют, что традиционный метод CGH является надежным методом обнаружения структурных аберраций и в определенных случаях может быть более эффективным при диагностике сложных аномалий.

Array CGH

Приложения Array CGH в основном направлены на обнаружение геномных аномалий при раке. Однако массив CGH также подходит для анализа аберраций числа копий ДНК, которые вызывают генетические нарушения у человека. То есть массив CGH используется для обнаружения делеций, амплификации, точек останова и аномалий плоидности. Ранняя диагностика приносит пользу пациенту, так как он может пройти соответствующее лечение и получить консультацию для улучшения своего прогноза.

Геномные аномалии при раке

Генетические изменения и перестройки часто возникают при раке и способствуют его патогенезу. Обнаружение этих аберраций с помощью массива CGH предоставляет информацию о местонахождении важных генов рака и может иметь клиническое применение в диагностике, классификации рака и прогнозировании. Однако не все потери генетического материала являются патогенетическими, поскольку часть ДНК-материала теряется физиологически во время перестройки субгенов иммуноглобулинов. В недавнем исследовании массив CGH был реализован для идентификации областей хромосомной аберрации (вариация числа копий ) в нескольких моделях рака груди на мышах, что привело к идентификации взаимодействующих генов во время индуцированного myc онкогенеза.

Массив CGH также может применяться не только для обнаружения хромосомных аномалий при раке, но также для мониторинга прогрессирования опухолей. Дифференциация между метастатическими и легкими поражениями также возможна с помощью FISH после выявления аномалий с помощью массива CGH.

Субмикроскопические аберрации

синдром Прадера-Вилли (PWS) - это отцовская структурная аномалия с участием 15q11-13, тогда как материнская аберрация в той же области вызывает синдром Ангельмана (AS). При обоих синдромах большинство случаев (75%) является результатом делеции 3–5 Mb критической области PWS / AS. Эти небольшие аберрации не могут быть обнаружены с помощью цитогенетики или обычного CGH, но могут быть легко обнаружены с помощью массива CGH. В качестве доказательства принципа Vissers et al. (2003) сконструировали широкий набор геномов с разрешением 1 Мб для скрининга трех пациентов с известными, подтвержденными FISH синдромами микроделеции, в том числе одного с PWS. Во всех трех случаях аномалии размером от 1,5 до 2,9 МБ были легко идентифицированы. Таким образом, было продемонстрировано, что массив CGH является специфическим и чувствительным подходом к обнаружению субмикроскопических аберраций.

При использовании перекрывающихся микроматриц также возможно выявить точки останова, связанные с хромосомными аберрациями.

Пренатальная генетическая диагностика

Использование массива CGH в качестве инструмента для доимплантационного генетического скрининга становится все более популярной концепцией, хотя и не является широко используемой методикой. Он может обнаруживать CNV и анеуплоидию в яйцах, сперматозоидах или эмбрионах, которые могут способствовать неудачной имплантации эмбриона, выкидышу или таким состояниям, как синдром Дауна (трисомия 21). Это делает массив CGH многообещающим инструментом для уменьшения количества жизненно важных условий и повышения успешности попыток ЭКО. Метод включает амплификацию всего генома из одной клетки, которая затем используется в методе массива CGH. Его также можно использовать в парах, несущих хромосомные транслокации, такие как сбалансированные реципрокные транслокации или робертсоновские транслокации, которые могут вызвать хромосомный дисбаланс у их потомства.

Ограничения CGH и массива CGH

Основным недостатком обычного CGH является его неспособность обнаруживать структурные хромосомные аберрации без изменений числа копий, таких как мозаицизм, сбалансированные хромосомные транслокации, и инверсии. CGH также может обнаруживать только прибыли и убытки относительно уровня плоидности. Кроме того, хромосомные области с короткими повторяющимися последовательностями ДНК сильно различаются у разных людей и могут мешать анализу CGH. Следовательно, повторяющиеся области ДНК, такие как центромеры и теломеры, необходимо блокировать немеченой повторяющейся ДНК (например, ДНК Cot1) и / или их можно исключить из скрининга. Кроме того, разрешение обычного CGH является основной практической проблемой, которая ограничивает его клиническое применение. Хотя CGH зарекомендовал себя как полезный и надежный метод исследования и диагностики как рака, так и генетических нарушений человека, его применение связано только с грубыми отклонениями. Из-за ограниченного разрешения метафазных хромосом аберрации размером менее 5–10 МБ не могут быть обнаружены с помощью обычного CGH. Для обнаружения таких аномалий требуется методика высокого разрешения. Array CGH преодолевает многие из этих ограничений. Матрица CGH характеризуется высоким разрешением, что является ее основным преимуществом по сравнению с обычным CGH. Стандартное разрешение варьируется от 1 до 5 Мбайт, но может быть увеличено приблизительно до 40 Кбайт путем добавления в массив дополнительных клонов. Однако, как и в обычном CGH, основным недостатком массива CGH является его неспособность обнаруживать аберрации, которые не приводят к изменениям числа копий, и ограниченная способность обнаруживать мозаицизм. Уровень мозаицизма, который можно обнаружить, зависит от чувствительности и пространственного разрешения клонов. В настоящее время перестройки, присутствующие примерно в 50% клеток, являются пределом обнаружения. Для обнаружения таких аномалий необходимо использовать другие методы, такие как SKY (спектральное кариотипирование) или FISH.

См. Также

Ссылки

Внешние ссылки

Последняя правка сделана 2021-05-15 07:58:42
Содержание доступно по лицензии CC BY-SA 3.0 (если не указано иное).
Обратная связь: support@alphapedia.ru
Соглашение
О проекте